牛奶中酪蛋白和乳糖的分离

牛奶中酪蛋白和乳糖的分离张意（200131040037）赵玉堃（200131040039）（武汉大学化学与分子科学学院，湖北，武汉，430072）牛奶是一种营养且易于消化吸收的物质。在婴儿及青少年时期，每天喝一定量的牛奶能促进身体健康成长。牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性把牛奶的PH值调到酪蛋白的等电点（PH=4.8）来沉淀分离酪蛋白。酪蛋白不溶于乙醇，故可用乙醇将其中的脂肪除去。乳糖是哺乳动物乳腺分泌的特有的碳水化合物，在牛乳中含量为4．7％，占干物质的38～39％。乳糖在乳中全部呈溶解状态存在。乳糖在乳中存在三种型态：-乳糖、-乳糖和少量醛型乳糖。另外，乳糖不溶于乙醇，所以当乙醇混入水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。一.材料与方法1.实验仪器：烧杯（250、100、50ml）；HH-6数显恒温水浴锅；DYY－Ⅲ型稳压电泳仪；简易抽滤装置；精密PH试纸；抽滤瓶；布氏漏斗；锥形瓶；数字旋光仪；蒸发皿。2.实验药品及材料：新鲜牛奶（伊力纯牛奶）；10％HAc溶液；碳酸钙；95％乙醇；乙醚和乙醇的混合液（1：1）；乙醚；考马斯亮蓝R试剂；硫酸铜；氢氧化钠。3.实验方法：（1）酪蛋白的分离操作：取20ml新鲜牛奶置于250ml烧杯中，加热至45℃，在搅拌下慢慢加入10％乙酸溶液，使混合物溶液的PH值为4.2，在这过程中不停的搅拌。过滤（在滤液中立即加入适量粉状碳酸钙，并搅拌几分钟，留作下面实验（2）用）。依次用适量的95％的乙醇，乙醇和乙醚的等体积混合液，乙醚洗涤沉淀1~2次，捣碎固体团块。用布氏漏斗过滤后把固体转移至表面皿上，让乙醚挥发掉，自然干燥，并对所得酪蛋白称重。现象：温水浴条件下缓慢滴加HAc溶液，有白色块状沉淀产生，搅拌后变成小颗粒状。过滤速度较慢，用乙醇及其它洗液洗后最终得白色颗粒状固体1.6g。用表面皿盖住放置一周后，颜色略显淡黄，且略带粘性，可能是因为带有微量脂肪。另外所得滤液澄清，置于100ml锥形瓶中。（2）乳糖的分离操作：把实验（1）中已经加入碳酸钙的滤液，用蒸汽浴加热蒸发，使水挥发至液体体积约3mL，再加入18ml无水乙醇，加热并搅拌使其混合均匀，趁热将混合物用布氏漏斗过滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙。把滤液转移至锥形瓶中盖上塞子，放置l－2天，让乳糖充分结晶，过滤，分离出乳糖晶体，待其干燥后，称重。现象：第二天观察发现锥形瓶壁上有乳糖晶体析出。将其刮下，过滤并洗涤晶体，称重得纯白色乳糖晶体1.2g。（3）酪蛋白的鉴定将少量酪蛋白溶解于水中，进行下列反应：（a）缩二脲反应：取少量酪蛋白酪于试管，加适量水和稀NaOH溶液使酪蛋白溶解，再向溶液中加入氨水和稀硫酸铜溶液，振荡试管，溶液颜色变为紫色。（b）蛋白质反应：取少量酪蛋白酪于试管，加入2ml水，再加入0.5ml硝酸，振荡，加热煮沸，溶液和沉淀都变成黄色。冷却后，加入过量氨水，溶液变成棕色，再加入HAc溶液，又变成黄色。（c）茚三酮反应：取少量酪蛋白溶于适量稀NaOH溶液中，加入少量稀茚三酮溶液，振荡后显紫色。此为α氨基酸的特征反应，可用于定性定量分析。茚三酮＋RCHNH2CO2H→RCHO+CO+3H2O+显紫色物质（4）乳糖的变旋光测定操作：精确称取1.25克乳糖，快速配成25ml水溶液，装入旋光管，迅速测定其旋光度，每隔一分钟测一次。10分钟后，每隔2分钟测一次，至20分钟为止，记录旋光度的数据。在乳糖水溶液中加入2滴氨水，摇匀，静置202分钟后测其旋光度，计算比旋光度。现象：由于乳糖的产量很少，只有1.2g，就先加入15ml水溶解，结果基本上不溶。于是另取一份乳糖来做。先预先将水加热至约25度，再加入乳糖，结果还是不能完全溶解。可能原因是乳糖不纯或者是水温不够，致使溶解速度过慢。经过观察，在当时的室温（8.5摄氏度）下，完全溶解基本上是不可能的。（5）酪蛋白的电泳试验操作：在纸的中心划一个点的一条横线，并在纸两端注明正负极，将纸两端浸入水中，当液面上升到距离中心1cm时，用事先准备好的酪蛋白溶液在中心点一点，放入电泳仪中，调节电流使每张纸分到的电流为3mA，电压为160V，盖上盖子。40分钟后，取出纸片，用电吹风吹干纸片，用显色剂考马斯亮蓝R试剂显色。现象：纸片上的横线周围有黄色出现，显色后，点了酪蛋白的地方呈粉红色，纸片为蓝色，但没有观测到其他现象。所以，可认为这次实验失败。二结果与讨论1.酪蛋白在牛奶中的存在形式酪蛋白的等电点为4.8，牛奶的PH值为6.6，因此酪蛋白在牛奶中主要是以负电荷的形式存在。在牛奶中加入酸，当达到其等电点时，酪蛋白便以沉淀析出，而钙仍以离于形式留在溶液中：Ca2+酪蛋白＋H+酪蛋白＋Ca2+2.本实验应采用新鲜牛奶本实验所用牛奶应为新鲜牛奶，效果最佳。若让牛奶在室温任意放置，牛奶就会变酸。牛奶中存在着多种细菌，特别是乳酸杆菌。这些细菌与牛奶中的乳糖作用生成有酸味的乳酸。实际上乳糖是由一分子一D一半乳糖与一分子D一葡萄糖以一1，4一苷键连结而成的还原性双糖。牛奶中的微生物把乳糖水解了，而且单从乳糖的丰乳糖部分产生出乳酸：3.脂肪对牛奶中酪蛋白和乳糖的分离的影响脂肪也是牛奶的主要成分之一，约占牛奶的3．9％。在分离酪蛋白时，脂肪会夹杂在酪蛋白中一起沉淀出来。因此在用乙醚洗涤酪蛋白时，应把块状的酷蛋白捣碎，并用搅拌棒搅拌约10min，尽可能除去脂肪。4.搅拌速度对分离的影响：将牛奶加热时搅拌速度可以快一些，但当滴加HAc时，应该先快搅拌，接近等电点时，应慢搅拌，当有块状沉淀产生时，停止搅拌。否则，沉淀变成颗粒状，影响后面的过滤速度。5.温度和酸度的影响虽然文献上报道：将牛奶的pH值调到4.8是最佳的，但实验证明：在温度为10.。C左右时，pH要调得更小－4.4左右。而且，当温度从35℃升到45℃和55℃时，酪蛋白凝结最大速率分别以8．5*10-3s-1增加到17．7*10-3s-1，和18．9*10-3s-1（参考文献：《温度和PH值对酪蛋白凝聚的影响作者：B.Y.KIM》）。将牛奶加热并加入10％乙酸溶液使酪蛋白沉淀时，注意不要加热过度，也不要加入过多量的乙酸或强酸，因为这些条件会使乳糖水解成葡萄糖和丰乳糖，从而在分离乳糖的实验中导致收得率的降低。6.碳酸钙的作用使用碳酸钙，主要是中和过剩的乙酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，影响收率。乳糖的结晶在析出乳糖晶体的滤液中，滤液应澄清，否则乳糖很难结晶。如果滤液不澄清，可在过滤前在溶液中加入1g助滤剂（如硅藻土）。如果结晶出未的乳糖有杂色，可用活性炭脱色，再进行重结晶。7.实验心得本次实验做得不够成功，但是我们也算有了一些小小的收获。对做设计实验有几点建议：a.设计实验应该组织学生先查好资料，再进实验室；b.进行实验时应先定性后定量，扎扎实实做好每一步；c.试验过程中鼓励同学们多交流经验，讨论方案；同时也鼓励少数能力强的同学尝试不同的实验方案，以做对照；d.应适当的增加设计实验的学时，让同学们有充足的时间和精力投入实验中来；e.实验的要求要适当提高，结果最好以论文形式上交。参考文献：1.陈忠平：《牛奶中酪蛋自和乳糖的分离》中国期刊网2.B.Y.KIM：《温度和PH值对酪蛋白凝聚的影响》中国期刊网3.童殿荣：《旋光仪测定新鲜牛乳中乳糖》中国期刊网4.武汉大学：《物理化学实验》武汉大学出版社5.张宗岩：《乳糖的物理特性》中国期刊网