TCA循环

第23章柠檬酸循环主要内容TCA准备阶段TCA循环阶段TCA循环的化学计量TCA循环的控制葡萄糖的主要分解代谢途径葡萄糖丙酮酸乳酸乙醇乙酰CoA6-磷酸葡萄糖磷酸戊糖途径糖酵解（有氧）（无氧）三羧酸循环（无氧）丙酮酸的有氧氧化及葡萄糖的有氧分解（EMP）葡萄糖COOHC==OCH3丙酮酸CH3-C-SCoAO乙酰CoA三羧酸循环NAD+NADH+H+CO2CoASH葡萄糖的有氧分解丙酮酸脱氢酶系TCA背景知识为什么称为柠檬酸循环、三羧酸循环（Tricarboxylicacidcycle,TCA）、Krebs循环？在有氧的情况下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、脱羧，最终生成C2O和H2O并产生能量的过程，称为柠檬酸循环，亦称为三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle),简称TCA循环。由于它是由H.A.Krebs（德国）正式提出的，所以又称Krebs循环。•“Itisconvenienttouseabrieftermforthekindofscheme.Itsessentialfeatureistheperiodicformationofanumberofdi-andtricarboxylicacids.Asthereisnotermwhichwouldserveasacommondenominatorforallthevariousacids,itseemedreasonabletonamethecycleafterone,orsome,ofitscharacteristicandspecificacids.Itwasfromsuchconsiderationsthatthetermcitricacidcyclewasproposedin1937.”（HansA.Krebs,Thecitricacidcycle,NobelLecture,December11,1953）Krebs,1901-1981柠檬酸循环是糖、脂肪、蛋白质和氨基酸等氧化所共同经历的途径。此外，柠檬酸循环生成的中间物质也是许多生物合成的前体。因次柠檬酸循环是两用代谢途径。糖的有氧氧化：葡萄糖或糖原在有氧的条件下，彻底氧化成CO2和水的过程。有氧氧化的反应过程•第一阶段：葡萄糖→→→丙酮酸（细胞液）•第二阶段：丙酮酸→乙酰CoA（线粒体）•第三阶段：三羧酸循环及氧化磷酸化（线粒体）OCH3-C-SCoACoASHNADH+CO2FADH2H2ONADH+CO2NADHGTP三羧酸循环（TCA）草酰乙酸再生阶段柠檬酸的生成阶段氧化脱羧阶段柠檬酸异柠檬酸顺乌头酸－酮戊二酸琥珀酸琥珀酰CoA延胡索酸苹果酸草酰乙酸NAD+NAD+FADNAD+1缩合2a脱水2b水化3氧化脱羧4氧化脱羧5底物水平磷酸化7水化8脱氢•柠檬酸循环中的酶分布在线粒体中。在真核生物中，丙酮酸首先要转运到线粒体内，然后才能进行转换成乙酰CoA的反应。•嵌在内膜中的丙酮酸转运酶可以特异地将丙酮酸从膜间质转运到线粒体的基质中，进入基质的丙酮酸脱羧生成乙酰CoA，经柠檬酸循环进一步被氧化。TCA准备阶段TCA准备阶段丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系催化下氧化脱羧形成乙酰辅酶A。丙酮酸脱氢酶系复合物含三种酶和五个辅助因子E1:pyruvatedehydrogenase,thiaminepyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyltransacetylase,lipoicacid,coenzymeA-SHE3:dihydrolipoyldehydrogenase,NAD+,FADIRREVERSIBLETCA准备阶段H+丙酮酸脱氢酶系作用机理（1）1.丙酮酸与TPP结合并脱羧形成羟乙基TPP。2.羟乙基TPP氧化转变成乙酰基同时转移到E2的辅基硫辛酰胺上。3.在E2上的乙酰基在E2催化下转移到CoASH上形成游离的乙酰CoA.从而形成了一个高能硫酯键。ThemechanisticdetailsofthefirstthreestepsofthepyruvatedehydrogenasecomplexreactionTCA准备阶段TCA准备阶段丙酮酸脱氢酶系作用机理（2）4.还原型的E2将二个SH基H转移到E3的辅酶FAD上形成还原型FADH5.E3上的还原型的FADH将H交给NAD+形成NADH，E3辅基又形成氧化型的FADTCA准备阶段丙酮酸脱氢酶系反应图解E1E3TCA准备阶段砷化物对硫辛酰胺的毒害作用有机砷化物和亚砷酸能与丙酮酸脱氢酶系中的E2辅基硫辛酰胺共价结合，使还原型的硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。这类砷化物同样表现在对酮戌二酸脱氢酶系的抑制上。R-As=O+HSHSRSRSR’-As+H2OTCA概貌2C6C柠檬酸6C异柠檬酸5C酮戌二酸4C琥珀酰CoA4C琥珀酸4C延胡索酸4C苹果酸4C草酰乙酸TCA第一阶段：柠檬酸生成H2O草酰乙酸OCH3-C-SCoACoASHH2O柠檬酸合成酶顺乌头酸酶1、草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸—催化此反应的酶为柠檬酸合酶；—反应的中间产物为柠檬酰辅酶A；—柠檬酸合酶属于调控酶，其活性受ATP、NADH、琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另一种抑制剂是丙酮酰CoA。—它是TCA循环的限速酶，由氟乙酸形成的氟乙酰CoA可被该酶催化形成氟柠檬酸，从而抑制下一步的顺乌头酸酶催化的反应。此称为致死性合成反应。TCA循环阶段S-CoAintermediate非洲的南部有一种植物（Dichapetalumcymosum）可以产生出氟乙酸，氟乙酸有剧毒，生成氟柠檬酸。氟柠檬酸类似于柠檬酸，是顺乌头酸酶的一个很强的抑制剂，所以氟乙酸会终止经柠檬酸循环的有氧代谢。氟乙酰CoA常作为杀虫药o哺乳动物体内柠檬酸合成酶以二聚体形式存在。o与草酰乙酸的结合使酶发生有利于和乙酰CoA结合的形变。TCA循环阶段柠檬酸合成酶的单聚体形式，绿色原子为柠檬酸，粉色原子为CoATCA循环阶段草酰乙酸与乙酰辅酶A形成柠檬酸，反应的中间产物为柠檬酰辅酶A。柠檬酸形成机制•柠檬酸合酶与乙酰辅酶A的甲基作用，形成负碳离子。•负碳离子攻击草酰乙酸的羰基碳，形成柠檬酰辅酶A。•柠檬酰辅酶A水解为辅酶A和柠檬酸。乙酰CoA中乙酰基与草酰乙酸缩合形成6碳的柠檬酸，经过2次氧化脱羧释放出两分子CO2后，形成4碳酸－琥珀酸，琥珀酸经过几步反应后又重新转换为草酰乙酸。由于草酰乙酸可以再生，所以柠檬酸循环可以看作是一个催化多步反应的催化剂，使得乙酰CoA中的二碳单位乙酰基氧化成2分子CO2。进入柠檬酸循环中的2个碳原子的去向２、柠檬酸异构形成异柠檬酸—催化此反应的酶为乌头酸酶；—反应的中间产物为顺乌头酸；—反应为先脱水后水化；—由于反应生成的异柠檬酸在下一步反应中迅速被氧化而使反应向生成异柠檬酸的方向进行。TCA循环阶段•顺乌头酸酶催化柠檬酸异构化为柠檬酸，反应分两步进行，经历一个顺乌头酸中间体。•反应具有严格的空间特异性。TCA循环阶段•顺乌头酸酶活性位点的铁硫聚簇。TCA循环阶段•氟乙酸到氟柠檬酸的转化TCA循环阶段TCA第二阶段：氧化脱羧CO2GDP＋PiGTPNAD+NADH+H+NAD+NADH+H+CoASH异柠檬酸脱氢酶CO2－酮戊二酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶３、异柠檬酸氧化生成－酮戌二酸—催化此反应的酶为异柠檬酸脱氢酶；—反应为TCA二次氧化脱羧中的第一个反应；—反应中间产物为不稳定的草酰琥珀酸；—既有以NAD+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶，也有以NADP+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶。—异柠檬酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受ADP和NAD+的变构激活，受ATP和NADH的变构抑制。TCA循环阶段-脱羧反应TCA循环阶段高等动植物及大多数微生物中异柠檬酸脱氢酶有两类：一类以NAD+为辅酶，存在于线粒体中，一类以NAPD+为辅酶，存在与线粒体和细胞质中。异柠檬酸脱氢酶是一个变构酶，活性受ADP变构激活。该酶与异柠檬酸、Mg2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。NADH、ATP对该酶起变构抑制作用。细菌中的异柠檬酸脱氢酶还受磷酸化（活化形式）和去磷酸化（失活形式）作用调节。•异柠檬酸的转变有两条途径：一是当需要能量时，进行氧化脱羧形成-酮戊二酸，二是在能量充足时，经异柠檬酸裂解酶作用，生成琥珀酸和乙醛酸4、－酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA—催化此反应的酶为－酮戌二酸脱氢酶复合体，该酶由－酮戌二酸脱氢酶E1、二氢硫辛酰转琥珀酰酶E2和二氢硫辛酰脱氢酶E3及六种辅助因子TPP、硫辛酸、CoA、NAD+、FAD、Mg2+组成；—反应为TCA二次氧化脱羧中的第二个反应；—反应释放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中；TCA循环阶段4、－酮戌二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA—－酮戌二酸脱氢酶是变构调节酶，其活性受产物琥珀酰CoA、NADH和高能ATP的变构抑制。—与丙酮酸脱氢酶复合体中E1不同的是该酶不受磷酸化与去磷酸化的共价修饰调节作用；TCA循环阶段ɑ-酮戊二酸氧化脱酸释放能量•促使NAD+还原•使反应向氧化方向进行释放能量•相当一部分能力以高能硫酯键的形式储存。5、琥珀酰CoA转化为琥珀酸并释放高能磷酸键—催化此反应的酶为琥珀酰CoA合成酶或称琥珀酰硫激酶；—该反应为TCA是唯一直接产生高能磷酸键的步骤，也是一步底物水平磷酸化产生能量的步骤；—反应生产的GTP在蛋白质的生物合成中起磷酰基供体及激活信号蛋白的作用，也可以与ADP磷酸化生成ATP相偶联产生能量。TCA循环阶段琥珀酸辅酶A转化为琥珀酸•反应要点：产生高能磷酸键哺乳动物体内形成GTP,植物和微生物体内形成ATP•反应特点：柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸键的步骤底物水平的磷酸化产生ATP，没有通过还原型辅酶的氧化。•琥珀酰CoA合成酶反应机制TCA循环阶段TCA第三阶段：草酰乙酸再生FADFADH2H2ONAD+NADH+H+草酰乙酸琥珀酸脱氢酶延胡索酸酶苹果酸脱氢酶6、琥珀酸脱氢生成延胡索酸—催化此反应的酶为琥珀脱氢酶；它以FAD为辅基；—该酶具有严格的立体专一性，即只生成反式延胡索酸；—与琥珀酸结构类似的化合物如丙二酸、戌二酸等是该酶的竞争性抑制剂。TCA循环阶段TCA循环阶段琥珀酸脱氢酶的铁硫聚簇FAD和琥珀酸脱氢酶的共价结合琥珀酸脱氢生成延胡索酸TCA中第三次氧化的步骤丙二酸为该酶的竞争性抑制剂该酶含FAD外，还有三种铁硫聚簇，2Fe-2S，3Fe-4S，4Fe-4S开始四碳酸之间的转变底物类似物丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。丙二酸结构类似于琥珀酸，也是个二羧酸，可以与琥珀酸脱氢酶的活性部位的碱性氨基酸残基结合，但由于丙二酸不能被氧化，使得循环反应不能继续进行。所以在分离的线粒体和细胞匀浆液中加入丙二酸后，会引起琥珀酸、-酮戊二酸和柠檬酸的堆积，这是研究柠檬酸循环反应顺序的早期证据。7、延胡索酸水合成L-苹果酸—催化此反应的酶为延胡索酸酶；—该酶具有严格的立体专一性，即只生成L-苹果酸；TCA循环阶段TCA循环阶段延胡羧酸酶的两种可能的反应机制8、L-苹果酸脱氢生成草酰乙酸—催化此反应的酶为苹果酸脱氢酶；—该酶的辅基为NAD+；—由于草酰乙酸与乙酰CoA合成柠檬酸的反应是高度放能反应，因此通过草酰乙酸的不断消耗来驱使该反应不断向生成草酰乙酸方向进行。TCA循环阶段TCA循环阶段以NAD+作为辅酶的脱氢酶的空间特异性比较TCA循环阶段苹果酸脱氢酶的结构TCA循环阶段TCACycle乙酰草酰成柠檬，柠檬易成α-酮琥酰琥酸延胡索，苹果落在草丛中。通过电子传递和氧化磷酸化每一分子的NADH被氧化为NAD＋时可以生成3分子ATP；而一分子FADH2被氧化为FAD时可以产生2分子ATP，因此一分子乙酰CoA通过柠檬酸循环和氧化磷酸化可以产生10分子ATP。如果将酵解阶段也考虑在内，一分子葡萄糖的降解可以产生多少ATP呢？1、总反应—离开循环的二分子CO2的碳并非来自进入循环的乙酰辅酶A，而分别来自异柠檬酸脱羧和-酮戌二酸脱羧反应；—每