第十八章重组人红细胞生成素生产工艺

第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺概述18.1.1红细胞生成素的种类18.1.2红细胞生成素的临床应用18.1.3红细胞生成素的理化性质18.1.4红细胞生成素的表达研究红细胞生成素第一节概述概述18.1.1红细胞生成素的种类红细胞生成素1、天然红细胞生成素的生成和作用原理1890：现象，低氧压下红细胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，EPO）动脉氧分压是EPO生成调节因素概述红细胞生成素2、天然红细胞种类1971年：从贫血羊血桨中分离出羊EPO1977年：从再障碍贫血患者的尿液中分离纯化出人EPOhEPO形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，165aa，活性类似糖基化及其含量不同：EPO-α含有较多的N-乙酰葡萄糖，总含糖量比EPO-β高。概述红细胞生成素3、红细胞生成素的生理作用红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生成刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异性刺激作用的细胞因子。EPO与靶细胞结合：骨髓、脾、肝细胞等，促进前体细胞增殖和分化，生成RBC概述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素第一代：两种，天然基因表达，rhEPO-α和rhEPO-β1989：Amgen,Epogen；1990，Biotech，ProcritrhEPO-α，CHO细胞生产Roche，NeoRecormon(rhEPO-β)，BHK细胞系概述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素用基因工程技术生产的人红细胞生成素第二代：EPO突变体2001，Amgen，Arasnep长效rhEPO-α突变体，170aa，有5个N糖基化位点唾液酸残基高2倍，半衰期36h（EPO为4-8h）CHO细胞系生产概述红细胞生成素适应症：各类贫血起因：慢性肾衰竭、AIDS、肿瘤、化疗等引起的贫血开发新的临床适应症：肾病和糖尿病在生物制品中排位NO.1，2004年全球销售额11.9BUSD，重磅炸弹药物各类体育竞技中，禁止使用的药物？18.1.2红细胞生成素的临床应用概述红细胞生成素大小：166aa糖链占分子量的39%糖基化程度与准确性对活性影响很大pI4.2～4.6，对热和pH变化相对稳定。18.1.3红细胞生成素的理化性质概述红细胞生成素天然提取制药工艺：由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。（未用生产）基因工程制药工艺：重组人红细胞生成素（应用生产中）化学制药工艺：基于红细胞生成素的受体，研究与红细胞生成素功能相当的化学药物（开发中）18.1.4红细胞生成素的表达研究概述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达红细胞生成素昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO概述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺红细胞生成素第二节工程CHO细胞系的构建细胞系的构建18.2.1表达载体的构建18.2.2转染18.2.3稳定性筛选红细胞生成素细胞系的构建18.2.1表达载体的构建人红细胞生成素基因的克隆策略：从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA，RT-PCR克隆全长序列将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为PhageT4连接酶表达载体的构建：人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。红细胞生成素细胞系的构建细胞培养：CHOdhfr-60%汇合；用无血清培养基洗涤3次脂质复合物制备：细胞载体prEPO和pDHFR与脂质体混合共感染：与无血清培养基混合，加到培养皿中，37℃，5%CO2，4h抗性克隆的获得：在相关的培养基中培养后进行抗性筛选18.2.2转染红细胞生成素细胞系的构建18.2.3稳定性筛选胰蛋白酶消化，1:5稀释，在含有1nmol/LMTX培养基上培养，3－4d更换培养基，培养10～14天，至抗性克隆出现。传代培养：1:5稀释，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX浓度逐次升高，筛选抗性克隆。抗性克隆培养于100mm培养皿中，按1:500稀释，继续培养3～5天，集落2-4mm。酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素。第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺红细胞生成素转瓶生产：Amgen公司反应器生产rhEPO的大规模生产方式培养过程与工艺控制红细胞生成素第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制培养过程与工艺控制18.3.1种子细胞制备18.3.2反应器培养工艺18.3.3培养过程控制红细胞生成素冻存的细胞株37℃水浴，无菌离心。加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。37℃、CO2培养箱培养，连续传三代。细胞消化后接种，制成接种细胞浓度(2.5×106个/ml)。培养过程与工艺控制18.3.1种子细胞制备红细胞生成素反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌1.5h。接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种。贴壁培养：pH7，50r/min，37℃，DO50-80%。扩增培养：80－100r/min，培养10d。灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。收获培养物，4℃－8℃保存。培养过程与工艺控制18.3.2反应器培养工艺红细胞生成素搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。温度控制：较为严格，恒定37℃。pH值控制：7.0-7.2,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体。葡萄糖控制：流加补料。代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害。培养过程与工艺控制18.3.3培养过程控制第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺红细胞生成素培养过程与工艺控制18.4.1初级分离18.4.2精制纯化18.4.3产品质量控制第四节分离纯化工艺红细胞生成素CM－Sephrose亲和层析：Na-HAc-异丙醇活化，并用20mmol/LTris-HCl平衡缓冲液平衡。收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层析柱，平衡缓冲液平衡。0～2mol/LNaCl，20mmol/LTris洗脱液梯度洗脱。透析：0.1mMTris，过夜，换液4次。培养过程与工艺控制18.4.1初级分离将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。红细胞生成素培养过程与工艺控制亲和层析法的四项要素：(2)SpecificBindingSubstance(B)洗脱Elution(4)配体Ligand(A)耦合反应(3)CouplingReaction杂质BBBB(1)SolidMatrixB红细胞生成素培养过程与工艺控制亲和层析法的作用机理：固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团配体XBAA红细胞生成素培养过程与工艺控制SDS-PAGE亲和层析法纯化CHOMTrypsinABC&DDisc-PAGEABC=D以凝胶电泳检验亲和层析操作过程各步骤样品→Chitin红细胞生成素透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。0～1mol/LNaCl-Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱，10%～70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。上凝胶柱（预先用20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。rhEPO产品：蛋白含量为1.2mg/ml，其比活可为2×105IU/mg。培养过程与工艺控制18.4.2精制纯化红细胞生成素纯度，蛋白质含量，分子量等体外活性：ELISA测定（原理免疫沉淀），单位unit（IU）体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。比活性(U/mg)：单位重量蛋白质(mg)中所含的活性培养过程与工艺控制18.4.3产品质量控制抗体药物制备鼠源单克隆抗体19.2.1杂交瘤细胞系的建立1、杂交瘤制备原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。抗体药物制备鼠源单克隆抗体2、杂交瘤制备过程制备工艺：•免疫动物•亲本细胞制备•细胞融合•培养筛选和鉴定•克隆化抗体药物制备鼠源单克隆抗体骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。有遗传标记，如HGPRT-或KT-。能在CM中生长良好利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进肿瘤的生长。2）骨髓瘤细胞制备抗体药物制备鼠源单克隆抗体取对数期骨髓瘤细胞和B淋巴细胞悬液，于离心管中以1:10混匀，离心、去上清在37℃下，使两者充分接触滴加PEG后，继续震动2min添加培养基稀释PEG，终止其作用离心后，置于培养板中用HAT培养基进行培养3）原生质体融合抗体药物制备鼠源单克隆抗体4）杂交瘤的筛选HAT选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。抗体药物制备鼠源单克隆抗体指将抗体阳性孔进行克隆化。保证HAT筛选后的杂交瘤克隆一个孔内只有一个克隆。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化。克隆化的方法，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。5）杂交瘤的克隆化抗体药物制备鼠源单克隆抗体HAT—次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷主路途径：利用糖和氨基酸合成嘌呤和嘧啶均需叶酸和作为氢的来源。A阻断二氢叶酸到四氢叶酸合成从而阻断主路途径，由于骨髓瘤细胞是HGPRT—和KT-，因此不能正常生长。旁路途径：次黄嘌呤-鸟嘌呤（HGPRT）或胸腺嘧啶(KT)核酸核糖途径。由于B细胞具有该途径，可在HAT培养基正常生长。