辅助降血糖功能评价方法

29附件3：辅助降血糖功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1试验项目1.1动物实验分为方案一（胰岛损伤高血糖模型）和方案二（胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型）两种1.1.1方案一（胰岛损伤高血糖模型）1.1.1.1体重1.1.1.2空腹血糖1.1.1.3糖耐量1.1.2方案二（胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型）1.1.2.1体重1.1.2.2空腹血糖1.1.2.3糖耐量1.1.2.4胰岛素1.1.2.5总胆固醇1.1.2.6甘油三酯1.2人体试食试验1.2.1空腹血糖1.2.2餐后2小时血糖1.2.3糖化血红蛋白（HbA1c）或糖化血清蛋白1.2.4总胆固醇1.2.5甘油三酯2试验原则2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。2.2根据受试样品作用原理不同，方案一和方案二动物模型任选其一进行动物实验。2.3除对高血糖模型动物进行所列指标的检测外，应进行受试样品对正常动物空腹血糖影响的观察。2.4人体试食试验应在临床治疗的基础上进行。2.5应对临床症状和体征进行观察。2.6在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3结果判定303.1动物实验：方案一：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，血脂（总胆固醇、甘油三酯）无明显升高，且对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。3.2人体试食试验：空腹血糖、餐后2小时血糖、糖化血红蛋白（或糖化血清蛋白）、血脂四项指标均无明显升高，且空腹血糖、餐后2小时血糖两项指标中一项指标阳性，对机体健康无影响，可判定该受试样品具有辅助降血糖功能的作用。31辅助降血糖功能检验方法MethodfortheAssessmentofAssistingBloodSugarReductionFunction1.动物实验1.1实验动物选用成年动物，选用小鼠（262g）或大鼠（18020g），单一性别，大鼠每组8－12只、小鼠每组10－15只。1.2材料1.2.1试剂四氧嘧啶（C4H2N2O4·H2O,分子量160.08）或链脲佐菌素、地塞米松磷酸钠注射液、葡萄糖或医用淀粉、血糖测定试纸或试剂盒，胰岛素、甘油三酯、总胆固醇测定试剂盒1.2.2高热能饲料猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持料52.6%1.2.3仪器血糖仪、全自动生化仪、可见光分光光度计、酶标仪、天平。1.3剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个模型对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设空白对照组。同时设给予受试样品高剂量的正常动物组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.4实验方法1.4.1正常动物降糖实验选健康成年动物按禁食3－5小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个剂量组。对照组给予溶剂，剂量组给予高剂量浓度受试样品，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较两组动物血糖值。1.4.2高血糖模型降糖实验方案一321.4.2.1胰岛损伤高血糖模型1.4.2.1.1原理四氧嘧啶（或链脲佐菌素）是一种细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛细胞，造成胰岛素分泌低下，引起实验性糖尿病。1.4.2.1.2造模方法购入成年动物，适应1天后，随机取15只动物禁食3－5小时，测空腹血糖，作为该批次动物基础血糖值。随后动物禁食24小时（自由饮水），注射四氧嘧啶（用前新鲜配制）造模，小鼠45－50mg/kgBW.iv静脉注射或125－130mg/kgBW.ip腹腔注射，大鼠50－80mg/kgBW.iv或120－160mg/kgBW.ip。5－7天后动物禁食3－5小时，测血糖，血糖值10－25mmol/L为高血糖模型成功动物。BW—bodyweigh体重1.4.2.1.3高血糖模型动物降糖实验选高血糖模型动物按禁食3－5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组（组间差不大于1.1mmol/L）。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。（实验前血糖值－实验后血糖值）血糖下降率%=--------------------------------------------×100％实验前血糖值1.4.2.1.4高血糖模型动物糖耐量实验剂量分组及受试样品给予时间同1.4.2。各组动物禁食3－5小时，测定给葡萄糖或医用淀粉前（即0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，15－20分钟后各组经口给予葡萄糖2.0g/kgBW或医用淀粉3－5g/kgBW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值或给医用淀粉后1、2小时的血糖值，观察模型对照组与受试样品组给葡萄糖或医用淀粉后各时间点（0、0.5、2小时）血糖值及血糖曲线下面积的变化。（0小时血糖＋0.5小时血糖）×0.5（2小时血糖＋0.5小时血糖）×1.5血糖曲线下面积＝———————————————+————————————————22方案二1.4.2.2胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型(任选其一)1.4.2.2.1地塞米松诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型1.4.2.2.1.1原理糖皮质激素具有拮抗胰岛素生物效应的作用，可抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用，促进蛋白质和脂肪的分解及糖异生作用，导致糖、脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.1.2试验方法购入健康雄性大鼠（15020g），普通维持料适应饲养3－5天，禁食3－4小时，取尾血，测定空腹即给葡萄糖前（0小时）血糖值，给2.5g/kgBW葡萄糖后测定0.5、2小时血糖值，作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组，即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组，每组15只。空白对照组不做处理，3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续35天。各组给予维持料饲养，1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料，喂饲2周后，模型对照组和3个剂量组在高热能饲料基础上分别给予地塞米33松0.8mg/kgBW腹腔注射（0.008%地塞米松注射量1ml/100g体重），每日1次，连续10－12天。试验结束，各组动物禁食3－4小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.2.2.1.3观察指标1.4.2.2.1.3.1空腹血糖、糖耐量各组动物禁食3－4小时，测定空腹血糖即给葡萄糖前（0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，15－20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kgBW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值，若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L，或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2小时）血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。（实验前血糖值－实验后血糖值）血糖下降率%=--------------------------------------------×100％实验前血糖值（0小时血糖＋0.5小时血糖）×0.5（2小时血糖＋0.5小时血糖）×1.5血糖曲线下面积＝———————————————+————————————————221.4.2.2.1.3.2胆固醇、甘油三脂各组动物禁食3－4小时，检测血清胆固醇、甘油三脂，若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型脂代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组血脂变化。1.4.2.2.1.3.3胰岛素各组动物禁食3－4小时，检测血清胰岛素，模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降，且动物糖/脂代谢紊乱成立，判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。血糖×胰岛素胰岛素抵抗指数=胰岛素/22.5e-㏑血糖≈——————————22.51.4.2.2.2四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型1.4.2.2.2.1原理高热能饲料喂饲基础上，辅以小剂量四氧嘧啶（C4H2N2O4·H2O,分子量160.08），造成糖/脂代谢紊乱，胰岛素抵抗，诱发实验性糖尿病。1.4.2.2.2.2造模方法购入健康雄性大鼠（15020g），普通维持料适应饲养3－5天，禁食3－4小时，取尾血，测定给葡萄糖前（即0小时）血糖值，给2.5g/kgBW葡萄糖后0.5、2小时血糖值，作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分5个组，即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组，每组15只。空白对照组不做处理，3个剂量组灌胃给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续33天。各组给予维持料饲养，1周后模型对照组和3个剂量组更换高热34能饲料，喂饲3周后，模型对照组和3个剂量禁食24小时（不禁水），给予四氧嘧啶103－105mg/kgBW腹腔注射，注射量1ml/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲3－5天。试验结束，各组动物禁食3－4小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。1.4.2.2.2.3观察指标1.4.2.2.2.3.1空腹血糖、糖耐量各组动物禁食3－4小时，测定空腹血糖即给葡萄糖前（0小时）血糖值，剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，空白对照组不做处理，15－20分钟后各组经口给予葡萄糖2.5g/kgBW，测定给葡萄糖后各组0.5、2小时的血糖值，若模型对照组0.5小时血糖值≥10mmol/L，或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型糖代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后（0.5、2小时）血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。（实验前血糖值－实验后血糖值）血糖下降率%=--------------------------------------------×100％实验前血糖值（0小时血糖＋0.5小时血糖）×0.5（2小时血糖＋0.5小时血糖）×1.5血糖曲线下面积＝———————————————+————————————————221.4.2.2.2.3.2胆固醇、甘油三脂各组动物禁食3－4小时，检测血清胆固醇、甘油三脂，若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高，与空白对照组比较，差异有显著性，判定模型脂代谢紊乱成立，在此基础上，观察模型对照组与受试样品组血脂变化。1.4.2.2.2.3.3胰岛素各组动物禁食3－4小时，检测血清胰岛素，模型对照组与空白对照组比较胰岛素抵抗指数无明显下降，且动物糖/脂代谢紊乱成立，判定胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型成功。观察模型对照组与受试样品组胰岛素抵抗情况。血糖×胰岛素胰岛素抵抗指数=胰岛素/22.5e-㏑血糖≈——————————22.51.5数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。1.5.1指标判定351.5.1.1正常动物降糖试验血糖指标：空腹血糖受试样品剂量组与对照组比较无统计学意义，判定对正常动物血糖无影响。1.5.1.2高血糖模型降糖试