植物DNA、质粒DNA的提取以及载体构建

植物DNA、质粒DNA的提取以及载体构建一、植物DNA的提取1、目的和意义2、原理3、试剂的准备4、操作过程5、DNA检测6、注意事项7、常见问题及解决办法1、目的和意义:1、抗性苗的检测2、分子杂交3、分子标记4、基因扩增2、原理:CTAB（十六烷基三甲基溴化铵hexadyltrimethylammomumbromide）是一种非离子去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，最后用75%的乙醇清洗沉淀，吹干，溶于TE中。3、试剂的准备试剂的全称：CTAB：十六烷基三甲基溴化铵EDTA：已二胺四乙酸二钠PVP:聚乙烯吡咯烷酮。试剂的配制（2×CTAB（100ml））2%CTAB：2g1.4mol/LNaCl:8.19g20mmol/LEDTA:4ml(0.5mol/L母液）100mmol/LTris·Cl(PH8.0):10ml（1mol/L母液）2%PVP:2g2%ß-巯基乙醇:2ml试剂的作用Tris-HCl(pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离EDTA：抑制DNase活性β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐化，使酚类物质容易去除PVP：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。4、操作过程（小样法）1、将水浴锅打开，调到65度，并将裂解液放到水浴锅中预热；2、挑取1-2g幼嫩的组织放到碾钵中，加入液氮迅速研磨成粉末；3、将粉末迅速转入1.5ml的离心管中，迅速加入裂解缓冲液，混匀，放入65度水浴锅水浴30min，期间晃动离心管2-3次；4、将离心管取出冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），混匀，静置10min；5、室温12000r离心10min，然后将上清转移至干净的新离心管中再抽提一次；6、将上清转移至干净的新离心管中，加入2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，混匀，静置沉淀30min，10000r离心10min；7、将上清倒掉，倒置离心管使残液流尽，加入500µ75%酒精，将沉淀摇起来放置5—10min，离心，倒掉酒精，重复一次；8、倒置离心管使残液流尽，离心，用枪头将残液吸干，吹干，溶于TE(10mMTris-HCl;1mMEDTAPH=8.0)；9、加入RNA酶，37度水浴1h或4度放置过夜；10、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，静置10min，12000r离心10min；11、将上清转入新的干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置30min，10000r离心10min；12、上清倒掉，用75%的乙醇清洗2次，倒掉酒精，离心，用枪头吸干残液，吹干，溶于TE即为可以进行分子操作的DNA。分光光度法：•DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA。•DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。5、DNA检测Marker定量法：•DNA的紫外检测通常使用荧光染料溴化乙锭，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光。•根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA样品进行定量。•使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获悉所检测DNA样品的完整性及其大小。DNA电泳图6、注意事项：1、在整个操作过程中要戴手套；2、使用液氮时要小心，不要溅到皮肤上，因为液氮温度很低，会把皮肤冻坏；3、加试剂时要在通风橱中加，因为有些试剂具有挥发性，会散发出难闻的气味，如巯基乙醇、氯仿等。4、每次吸取上清液时一定要轻柔，否则会吸到下面的液体；5、每次混匀的时候要轻柔，因为DNA裂解出来之后用力摇晃的话易使DNA断裂；6、使用离心机的时候一定要注意平衡，否则会损坏离心机。7、每次废液都要倒到废液瓶中，不可随处倾倒。8、一次性手套不可遗弃在通风橱内，以免被吸入堵塞通风橱补充：高质量DNA的提取相对于普通提法增加的步凑：1、预处理2、NH4AC去除多糖3、酚去除蛋白质4、高盐TE去除残余的多糖二、质粒DNA的提取1、质粒的概念：质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状DNA分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。2、质粒的特点1、质粒不是细菌生长所必需的遗传物质，可自行丢失或人工处理而消除；2、携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境下生存；3、能独立于染色体之外进行复制和遗传；4、常包含编码对宿主有利的酶的基因；5、天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(scDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型试剂的配置液体I：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(Ph8.0)配制好后高压灭菌，于4℃冰箱保存液体II：0.4mol/LNaOH2%SDS溶液II要现用现配，室温下使用液体III：5mol/L乙酸钾60.0ml冰乙酸11.5mlH2O28.5ml配好后高压灭菌，于4℃冰箱保存，用时置于冰上实验原理加入溶液I使菌体悬浮。加入溶液II后SDS使菌体细胞壁、细胞膜破裂，使细胞内核酸释放出来，同时NaOH处理可破坏DNA碱基配对，使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。加入溶液III后，宿主的线状染色体DNA未来得急复性就在冰冷条件下与SDS、蛋白质、高分子量RNA缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA处于拓扑缠绕状链，迅速得到准确配对，重新形成完全天然的超螺旋分子，处于溶解状态保留在上清中。操作步骤1、挑取单菌落于加有一定浓度的抗生素的LB液体培养基中，200r/min，37℃震荡培养过夜。2、将菌液转移到1.5ml的离心管中，10000r离心1min。3、弃上清，将管子倒置于滤纸上，使残液流尽，加入200µ液体I，于涡旋振荡器上震荡，使菌液充分重悬。4、加入新配制好的400µ液体II，盖紧管子快速颠倒混匀，不可剧烈震荡，静置5min。5、加入预冷的300µ液体III，颠倒离心管数次，冰浴5min，12000r离心5-10min。6、上清转入干净的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），混匀，静置5-10min，12000r离心10min。7、上清移入干净离心管，加入2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，混匀，静置沉淀20min，12000离心10min。8、弃上清，倒置离心管使残液流尽，用75%的乙醇洗涤两次。9、弃上清，倒置离心管使残液流尽，将离心管离心几分钟将残液离到管底，用枪头将残液吸干，吹干。10、将沉淀溶于30µ的TE溶液中，于4℃或-40℃保存备用。11、质粒的检测：对质粒的检测我们一般就是进行电泳检测。11、质粒的检测：对质粒的检测我们一般采用电泳检测。注意事项1、加入液体I后一定要充分悬浮菌体细胞，确保没有结块的菌体，否则细胞裂解不充分，质粒产量会降低。2、溶液II在室温较低时特别是在冬天，容易产生沉淀。如果有沉淀产生，一定要水浴加热溶解，并混匀后才能使用。3、如果抗生素失效，或浓度太低可能会导致杂菌大量扩增，从而得不到质粒或得到很少质粒。大肠杆菌生长时间过长或过短，也会导致抽提不到质粒或质粒产量很低。补充：仪器的使用1、称量天平的使用：天平是配制试剂的时候称量试剂用的，每次使用是要用称量纸垫着，避免试剂直接接触天平，否则天平就会被腐蚀，影响称量的准确性和天平的使用寿命。另外，每次使用完之后要把天平用软毛刷扫干净，以免洒落的试剂腐蚀天平。2、通风橱的使用：通风橱是由外向内抽风的，目的是为了避免在实验过程中挥发性气体污染室内，因此在使用的时候要保持通风橱的通畅，注意不要把手套放在通风橱里面，以免吸到排风口里面堵塞排风孔而导致通风橱不能正常工作。3、离心机使用的注意事项使用离心机的时候首先要调平衡，没有调平衡的话容易损坏转轴，从而损坏离心机；其次在使用过程中会有离心管破裂而导致试剂漏在离心机里面，发生这种情况要及时将露出的试剂处理干净，将离心机擦干净，以免试剂腐蚀离心机。三、载体的构建载体（vector）：是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具，按功能可以分为克隆载体和表达载体。克隆载体：是指用于扩增或保存外源DNA片段而设计的载体。多克隆位点(multiplecloningsite)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmpr克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。③载体都具有合适的遗传标记基因。④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。表达载体：在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。表达载体构建的一般步骤：酶切连接转大肠杆菌PCR检测重组质粒的提取酶切检测转化农杆菌PCR检测保菌酶切：1、确定酶切位点；2、确定体系、缓冲液和酶的最佳反应温度；3、配制反应液：buffer:2酶：0.5DNA：3ddH2O:补足20µ连接：T4buffer：1DNA片段：6Vector：2T4连接酶：1配制好之后放连接仪16℃连接过夜。转化大肠杆菌：连接液加入感受态大肠杆菌冰浴30min42℃水浴热激90s冰浴5min加入400预培养1h左右涂平板PCR检测：挑取平板上的单菌落进行PCR检测。酶切检测：摇菌提取质粒酶切电泳检测转化农杆菌：将重组质粒到感受态农杆菌中冰浴30min液氮速冻3min37℃水浴5min冰浴5min加入400液体LB预培养4h涂平板农杆菌PCR检测：挑菌PCR电泳保菌：甘油浓度15%—20%，混匀放-40℃保存DNA和载体酶切大肠杆菌菌落PCR和酶切检测农杆菌菌落PCR