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@资料分享平台第一章绪论一、细胞生物学概况二、细胞生物学简史三、细胞生物学研究内容四、细胞生物学学习方法一、细胞生物学概况(P1)1、什么是细胞生物学？细胞生物学（cellbiology）是研究细胞基本生命活动规律的科学，是现代生命科学的重要基础学科之一；它从显微、亚显微和分子三个层次以动态的观点来研究细胞和细胞器结构与功能，探讨细胞的各种生命活动规律。2、细胞是所有生物体（不包括病毒）一切生命活动的基本单位具有自我复制、自我装配和自我调控的能力，通过与外界物质和信息交流，保持自身动态平衡。病毒、生物大分子和细胞的关系“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找”3、细胞生物学分支细胞形态学细胞遗传学细胞化学细胞生理学细胞分类学细胞免疫学二、细胞生物学发展简史（P8）五个阶段1、细胞的发现1665年RobertHooke（英）(30×)“cellar”——cell1677年LeeuwenHoek（荷兰）（300×）活细胞观察，第一次观察到原生动物、人类和动物的精子。2、细胞学说的建立1838－1839Schleiden和Schwann（德）分别提出了细胞学说（celltheory）；基本内容:所有生物都是由一个或者多个细胞构成的；细胞是生命的基本单位。1858年RodulfVirchow（德）对细胞学说进行了重要补充：细胞只能来自细胞。意义：19世纪自然科学三大发现之一；现代生物学三大基石之一。3、细胞学经典时期——19世纪的后25年(P9)原生质理论的提出：protoplasm1861年，MaxSchultze：有机体的单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体是相似的。细胞分裂的研究：有丝、减数分裂；重要细胞器的发现。4、实验细胞学及发展（1900－1953）(P10)experimentalcytology——用实验的手段研究细胞学的问题,即从形态结构的观察深入到生理功能、生物化学及遗传发育机理的研究。细胞遗传学细胞生理学细胞化学5、细胞生物学学科形成、发展（20世纪50年代——）(P12)@资料分享平台1953年DNA结构的发现——分子生物学诞生；1965年，D．P．Derobetis将《普通细胞学》改为《细胞生物学》，标志着细胞生物学的诞生。新研究技术手段的促进：电子显微镜、超薄切片、扫描隧道显微镜、细胞化学、分子生物学……80年代：分子细胞生物学（MolecularCellBiology）细胞生物学发展历史(总结)1、细胞的发现、细胞学说的创立（1665～1874）；2、细胞学的经典时期（1875～1900）；3、实验细胞学时期（1900～1953）；4、细胞生物学的诞生和发展（1953～）三、细胞生物学的研究内容(P2)1、膜学和细胞器学生物膜——细胞质膜和细胞内膜的总称，细胞物质交换、能量转换、信息交流的关键功能部位。细胞器学——探讨细胞器的结构和功能2、核学和染色体学细胞生物学、分子遗传学、发育生物学共同关注的焦点之一，研究染色体结构动态变化与基因表达及其调控的关系。3、细胞骨架体系4、细胞分裂和细胞分化5、细胞凋亡6、细胞工程学四、细胞生物学学习方法1、细胞是生命结构和功能的基本单位，细胞生物学在生命科学研究领域具有重要地位；2、明确细胞的结构和功能的一致性；3、从显微、亚微和分子三个层次来认识细胞的结构与功能；4、和多学科知识相结合，同分子生物学、生物化学、遗传学、生理学等课程紧密联系；5、注意细胞生物学各章节之间内容的相互关联；6、关注学科前沿；关注新技术方法进展；学习一点科技史。本章完一、细胞生物学概况二、细胞生物学简史三、细胞生物学研究内容四、细胞生物学学习方法一、光学显微技术(P49)1、普通复式光学显微镜技术①组成：光学放大系统、照明系统、机械系统；②性能参数：放大倍数、分辨力、清晰度、焦点深度、镜像亮度等，其中最重要的是分辨力。分辨力（分辨率、分辨本领）：能分辨两个物点之间最短距离的能力。该距离越小，则分辨力越高。显微镜的分辨力计算公式：③普通光镜分辨极限α最大值140°；λ最小波长450nm；N最大值1.5；因此普通光镜的分辨力极限为0.2微米，此数值亦为显微水平和亚微水平的分界点。普通光镜有效放大倍数（经验值）＝物镜最大镜口率×1000@资料分享平台④提高光学显微镜分辨力的手段a、缩短照明光线波长；b、应用特殊光学效应，增强反差。显微镜技术和计算机技术结合倒置显微镜2、荧光显微镜技术(P49)（fluorescencemicroscopy）①原理：以紫外光为光源，激发标本中的荧光物质产生荧光，从而对某些物质进行定性和定位分析。②荧光种类：自发荧光：细胞内某些天然物质被UV激发产生的荧光，如叶绿素产生血红色荧光。诱发荧光：细胞中加入荧光染料，与特定成分结合，经过UV照射发出荧光。荧光显微镜的工作原理OlympusBX－51荧光显微镜3、激光共聚焦扫描显微镜(P50)（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）4、相差和微分干涉显微镜技术(P50)①相差显微镜：phasecontrastmicroscope,Ph）1935年荷兰物理学家FritsZernicke发明了相差显微镜，它利用光的衍射和干涉原理，将人眼无法感受到的光的相位差转换成为人眼可以感受到的振幅差，从而将无色透明物体中的细节表现为明与暗的对比，适合观察活细胞和未染色的样品。普通光学显微镜相差显微镜②微分干涉显微镜(P51)（differential－interferencemicroscope，DIM）DIM获得的反差取决于光线穿过样品折射率变化的速率。样品边缘结构反差增大（相对小的距离内折射率发生明显变化）。Nomarskimicroscope二、电子显微镜技术(P51)1、透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）电子显微镜是模仿光学显微镜的工作原理，用电子束来代替可见光束，用电磁线圈代替玻璃透镜汇聚电子束，通过荧光屏或者胶片捕获图像的观察工具，理论分辨率可达0.2nm。HITACHIH-8100透射电子显微镜电子显微镜基本构造(P52)电子显微镜基本构造电子显微镜基本构造电子显微镜基本构造超薄切片制备2、透射电镜特点①“照明”光源——电子束②放大倍数调节方式——改变磁透镜电流强度③高电压工作——几万～十几万伏④内部高真空——10－4托⑤样品厚度90nm——电子穿透力有限，产热⑥标本染色技术不同——重金属盐（正染，负染）⑦冰冻蚀刻（冰冻断裂）技术freeze－etching（freeze－fracture）样品于-190℃快速冰冻——在真空中用冷却刀切割撕裂——真空中冰升华——暴露出的断裂面喷碳膜或者碳-铂膜（表面复型膜）——用有机溶剂或酶去除样品——将膜金属喷镀后在电镜下观察2、扫描电子显微镜（P58）（scanningelectronmicroscope，SEM）SEM发明于1965年，它是利用电子束扫描样品表面，再通过检测样品表面逐点散发的二次电子，将样品表面的形貌逐点成像并合成为放大的图像。PHILIPSXL20扫描电子显微镜@资料分享平台扫描电镜的特点：①可观察较大较厚的样品；②景深大，获得的是清晰逼真的三维立体图像；③放大倍数在20～20万倍间连续变换，无需多次聚焦；④样品可在样品室内多方位移动和转动；⑤分辨力不太高：3～10nm⑥只能观察标本表面，不能观察内部。3、扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）（P59）1981年发明的用于探测微观世界物质表面形貌的仪器。利用量子力学中的隧道效应。扫描隧道电镜下的DNA双螺旋STM的特点：①具有原子尺度的高分辨本领；②真空、大气、液体环境中都能工作，不接触样品，保持样品原貌。原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）第二节细胞组分的分析方法一、超速离心技术（P60）离心技术原理由于不同的细胞器具有不同的密度和体积，因此，可以利用离心方法加以分离和纯化。1、差速离心（differentialcentrifugation）利用不同的离心速度产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。适合分离沉降速率差别较大的亚微结构颗粒。多次离心达到纯化的目的2、密度梯度离心（P61）①蔗糖密度梯度离心②氯化铯密度梯度离心将介质形成一函盖所有组分密度的密度梯度，不同的样品由于其密度差异，在离心过程中进入到等密度介质区域即不再移动，从而实现分离的目的。蔗糖密度梯度离心和氯化铯密度梯度离心的比较二、组织化学和细胞化学（P61）利用一些显色剂与被测物质中的某些基团特异性结合，来判断核酸、蛋白质（酶）、糖类、脂类在细胞中的分布和含量。福尔根（Feulgen）反应——显示DNA格莫瑞（Gomori）反应——显示碱性磷酸酶三、免疫细胞化学（P62）（Immunocytochemistry，ICC）根据抗体能与对应的抗原自行识别结合的免疫学原理，来检测特定蛋白质在细胞内的分布状况和含量。人成纤维细胞中肌动蛋白束（800×）BHK细胞中的微管蛋白（500×）四、细胞内特异核酸序列的定位和定性研究对象：细胞内特异核酸（DNA或RNA）目的：进行定位、定量分析方法：原位杂交（insituhybridization，ISH）以目标核酸的互补序列为探针，对细胞或者组织标本进行杂交处理，使目标核酸可视呈现的技术。是细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学相互交融的研究手段。构建DNA分子物理图谱光谱核型分析（spectralkaryotype，SKY）SKYofHuman五、定量细胞化学分析技术P65细胞分选（cellsorting）@资料分享平台是细胞生物学中较新技术，是利用流式细胞仪（flowcytometery，FCM）对细胞或者其他生物微粒（如染色体）进行分选，并对其进行定量分析（大小、形状、核酸含量和蛋白质含量等）的技术。1、流式细胞仪（FCM）是集合了流体喷射、激光、伽马射线能谱、电子计算机、显微荧光光度计量等技术于一体的设备;可以定性和定量分析生物颗粒（包括细胞）的物理化学特性并将之分离纯化;目前的FCM已经运用于细胞生物学、肿瘤学、免疫学、血清学、药物学等研究领域，可以用来分析免疫复合物、病毒、脂质体、细胞器、原核细胞、真核细胞、简单多细胞生物等等。流式细胞仪结构和工作原理2、标记细胞：免疫荧光染色荧光素标记抗体：异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红素（PE）、Texas红（TexasRed）荧光染色分为：直接染色和间接染色荧光染料直接染色使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）或者DAPI，对固定处理过的细胞或者细胞核直接进行染色，利用这些荧光染料嵌合入双螺旋结构堆积的碱基之间，使得所有双链区域均被染色。再利用FCM根据细胞激发的荧光的差异对细胞加以分离。第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养P661、什么是细胞培养是指从机体内取出某种组织或者细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。细胞培养示意图2、细胞培养分类：按照培养过程中培养物是否经过了分割，分类为：①原代培养（primaryculture）②继代培养（secondaryculture）或者再培养（subculture）①原代培养（primaryculture）直接从机体取出组织或者细胞后所进行的首次培养。②继代培养（secondaryculture）/传代培养（subculture）当原代培养的细胞增殖到一定的密度后，将其从原培养容器中取出，按照一定的比例向另外一个或者多个容器中所进行的再培养，简称传代。传代的累计次数就是细胞的代数。两个概念细胞系（cellline）：通过原代培养并且经过传代后所形成的细胞