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第十六章转基因技术与作物育种转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。它涉及目的基因的分离与改造、载体的构建及其与目的基因的连接等DNA重组技术；通过农杆菌介导、基因枪轰击等方法使重组体进入受体细胞或组织以及转化体的筛选、鉴定等遗传转化技术和相配套的组织培养技术；获得携带目的基因的转基因植株(遗传工程体)；遗传工程体在有控条件下的安全性评价以及大田育种研究直至育成品种。与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势。主要体现在：(1)转基因育种技术体系的建立使可利用的基因资源大大拓宽。实践表明，从动物、植物、微生物中分离克隆的基因，通过转基因的方法可使其在三者之间相互转移利用。(2)转基因育种技术为培育高产、优质、高抗，适应各种不良环境条件的优良品种提供了崭新的育种途径。这既可大大减少杀虫剂、杀菌剂的使用，有利于环境保护，也可以提高作物的生产能力、扩大作物品种的适应性和种植区域。(3)利用转基因育种技术可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择，同时随着对基因认识的不断深入和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难以想象的。(4)利用转基因技术可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，通过转基因的方法，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。正是由于转基因技术育种具有上述强大的优势，使得转基因技术从发现到如今仅仅30年的历史就得到了快速的发展。第一节作物的转基因技术一、转基因技术的发展现状(一)国际转基因植物研究与现状自从20世纪70年代重组DNA技术创建到1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有35个科120种植物转基因获得成功。先后有30多个国家批准了3000多例田间试验，涉及的植物种类有40多种，2000年已有13个国家种植了商品化的转基因植物。1996—2001年全球转基因作物种植面积增加很快(图16—1)。到2001年全世界已种植转基因作物5260万hm2。目前所种植的转基因作物主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以转基因大豆的种植面积最大。转基因作物的主要目标集中在培育具有抗除草剂特性的农作物优良品种,其次为培育抗虫和毒病新品种上。(二)我国转基因作物研究与利用概况我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60％，产量比对照增加15％，产值增加20％，1992年每亩增产200元，遗憾的是由于市场的原因现已不推广。据农业部资料，到1999年我国已批准进行中试的转基因作物有48项，包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49项，包括水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种。目前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花、美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉、延迟成熟期的转基因番茄、抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄、抗CMV转基因甜椒及转查尔酮合酶(CHS)反义RNA基因矮牵牛。但是除了转基因抗虫棉已经大面积生产外，后几种作物的种植面积仅在1hm2左右。二、转基因育种的程序利用转基因技术进行作物育种的基本过程可分为：目的基因或DNA的获得；含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建；受体材料的选择和再生系统的建立；转基因方法的确定和外源基因的转化；转化体的筛选和鉴定；转基因植株的育种利用。(一)目的基因的获得目的基因的获得是利用作物转基因育种的第一步。根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物——蛋白进行基因克隆；从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。(二)目的基因重组质粒的构建通过上述方法克隆得到目的基因只是为利用外源基因提供了基础，要将外源基因转移到受体植株还必须对目的基因进行体外重组。质粒重组的基本步骤包括：从原核生物中获取目的基因的载体并进行改造；利用限制性内切酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。已经分离的目的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助质粒中，常用的有pBR322系列、pUC以及pBluescriptK+(—)系列等。在进行外源基因转移前还必须将外源基因重组到合适的载体上，具体采用哪种载体要根据转基因的方法和目的而定。Ti质粒转化载体的结构见图16—6、16—7。(三)受体材料的选择受体是指用于接受外源DNA的转化材料。能否建立稳定、高效、易于再生的受体系统是植物转基因操作的关键技术之一。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：①高效稳定的再生能力；②受体材料要有较高的遗传稳定性；③具有稳定的外植体来源，即用于转化的受体要易于得到而且可以大量供应，如胚和其他器官等；④对筛选剂敏感，即当转化体筛选培养基中筛选剂浓度达到一定值时，能够抑制非转化植株细胞的生长、发育和分化，而转化细胞、植株能正常生长、发育和分化形成完整的植株。虽然对植物组织培养的研究已有几十年的历史，对于许多重要的农作物已经建立起比较成熟的再生系统，但是建立一个良好的基因转化受体系统与现有的组织培养获得再生植株水平之间还有很大的差距。目前受体材料系统存在的主要问题是：再生率低，基因型依赖性强，再生细胞部位与转化部位不一致等，常用的受体材料有以下几大类型。1．愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统是指外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，再通过分化培养获得再生植株的再生系统。愈伤组织受体再生系统具有外植体材料来源广泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且转化效率高的优点；缺点是转化的外源基因遗传稳定性差，容易出现嵌合体。2．直接分化再生系统直接分化再生系统是指外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。此类再生系统的优点是获得再生系统的周期短、操作简单，体细胞变异小，并且能够保持受体材料的遗传稳定性；缺点是对于有些植物，尤其是包括玉米、小麦、水稻在内的多数禾本科作物进行茎尖分生培养相当困难，遗传转化率要比愈伤组织再生系统低。3．原生质体再生系统由于原生质体具有全能性，能够在适当培养条件下诱导出再生植株，也可以作为受体材料，事实上原生质体受体系统是应用最早的再生受体系统之一。原生质体受体再生系统的优点是能够直接高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，可以获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，并适用于多种转化系统；缺点是不易制备、再生困难和变异程度高等。4．胚状体再生系统胚状体是指具有胚胎性质的个体。胚状体作为外源基因转化的受体具有个体数目巨大、同质性好，接受外源基因的能力强，转基因植株嵌合体少，易于培养、再生等优点。不足之处是所需技术含量较高，多数禾本科作物在内的许多种植物上不易获得胚状体，使胚状体再生受体系统的应用受到了很大的限制。5．生殖细胞受体系统利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统被称为生殖细胞受体系统。目前主要从两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导人法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。由于该受体系统与上述其他受体系统相比有许多优点，因此近年来发展很快。(四)转基因方法的确定和外源基因的转化选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转化率的重要环节之一。尽管转基因的具体方法很多，但是概括起来说主要有两类。第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的DNA的直接转化。1．载体介导转移系统载体法是目前为止最常见的一类转基因方法。其基本原理是将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导人植物细胞并整合在核染色体组中，并随着核染色体一起复制和表达。农杆菌Ti质粒或Ri质粒介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。采用载体介导进行基因转移的具体方法包括：(1)叶盘法。叶盘法是双子叶植物较为常用、简单有效的方法。选取健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养，农杆菌通过伤口感染将外源目的基因导人细胞内并整合到植物基因组中。(2)真空渗入法。将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。这是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。(3)原生质体共培养法。原生质体法是指在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌的Ti或Ri上携带有目的基因的T—DNA区段就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内，并整合到受体基因组上。2．外源基因直接导入法外源基因直接导人技术是一种不需借助载体介导，直接利用理化因素进行外源遗传物质转移的方法，主要包括化学刺激法、基因枪轰击法等。(1)化学刺激法。化学刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或者多聚—L—鸟苷酸(PLO)等细胞融合剂的作用，使细胞膜表面电荷发生紊乱，干扰细胞间的识别，使细胞膜之间、DNA／RNA与细胞膜之间形成分子桥，促使细胞膜间的相互融合(接触和粘连)和外源DNA／RNA进入原生质体。(2)基因枪轰击法。基因枪轰击法也称为微弹轰击技术和粒子枪法，其基本原理是将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，然后借助高压动力射人受体细胞或组织，当微粒上的DNA进入细胞后将整合到植物基因组中并得以表达。按照动力来源可将基因枪分为火药动力基因枪、高压气体动力基因枪和高压放电动力基因枪。由于基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织，这就克服了受体材料的限制，而且不必制备原生质体，因此实验步骤简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和创造转基因植物的最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在烟草、豆类和多数禾本科农作物、果树花卉和林木等植物上获得转基因植株。(3)高压电穿孔法。又称为电击法，是利用高压电流脉冲在细胞质膜上形成瞬间微孔，使DNA直接通过微孔或者作为微孔闭合时伴随发生的膜组分重新分布进入细胞质并整合到宿主细胞中。与原生质体融合和磷酸钙沉淀法相比，通过高压电穿孔法获得的转化植株外源DNA整合拷贝数较低，对受体细胞的选择性不强，但是要获得对特定的宿主细胞的最佳转化条件(如电场强度、电击时间等)需要大量的前期工作。(4)微注射法。此法是利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。所用受体一般是原生质体或生殖细胞，对于具有较大子房或胚囊的植株则无须进行细胞固定，在田间就可以进行活体操作，被称为“子房注射法”或“花粉管通道法”。微注射法的优点是可以进行活体操作，不影响植物体正常的发育进程。田间子房注射操作简便、成本低。但只对子房比较大的植物有效，对于种子很小的植物操作要求精度高，需要显微操作，转化率也相对较低，而且转基因后代容易出现嵌合体。(5)其他直接转化方法。随着科技的不断前进，人们先后又发明了多种直接转化方法，如超声波介导法、脉冲电泳法和离子束介导等方法，但是由于上述方法技术还不成熟、转化率低，有的原理不清楚或者是所需设备太昂贵，因此在实际中的应用受到了限制。(五)转化体的筛选和鉴定1．转化体的筛选外源目的基因在植物受体细胞中的转化频率往往是相当低的，在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞则更加稀少。为了有效地选择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择标记