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miRNA研究现状及技术路线内容概要miRNA简介miRNA研究的应用领域miRNA研究的技术路线miRNA研究背景1993年，在线虫中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA分子。2001年德国，英国，美国三个实验室运用生物信息学和分子生物学手段发现大量的miRNA.2002年，Science杂志将“SmallRNA&RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将SmallRNA评为年度重大科技成果之一。2005年，microRNA的研究第五次入选“十大科技突破”。。。。。。。。。miRNA定义(MicroRNAs，miRNAs)是一种广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，不具有编码功能，定位于RNA前体的3’端或者5’端。miRNA的生物学特征19-25nt的单链小分子，存在于真核生物中，非编码序列，没有ORF，在3’端有1～2个碱基的长度变化能够互补配对结合于基因序列的侧翼区域，阻遏或抑制靶mRNA的翻译由核酸酶Dicer作用于前体的双链而生成的产物含有3’羟基和5’磷酸的核苷酸片段，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来大多数miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的形式转录出前体转录本，且大部分位于独立的转录单位中miRNA在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNA的产生与功能1.在细胞核内转录成前体转录本2.被RNaseⅢ核酸酶Drosha加工成约70-90nt的发夹状pre-miRNA3.转运到细胞质被Dicer加工成成熟的miRNA4.双链miRNA分子被解链，单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP(RISC)5.通过与靶基因的3‘UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制。miRNA的作用机制miRNA的调控特点交叉调节：动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一个miRNA都可能作用于不同的mRNA，一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节。自我调节：自我调节参与了miRNA的生物合成和功能。例如,参与miRNA生物合成的一些酶也受到其产物miRNA的调节。Dcl1mRNA编码一种植物Dicer蛋白参与miRNA的生成,同时它也是miR2162的靶分子。可逆性调节：miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当mRNA作为miRNA抑制的靶分子后,mRNA会被送至胞浆内的P体(Pbodies)重新定位。miRNA调节方式的优点与蛋白水平的调节相比，更加节省能量与转录水平调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用microRNA基因组分布60%独立表达15%成簇表达25%的miRNAs位于内含子植物与动物miRNA的区别动物植物前体茎环结构短，简单长，复杂，折回长度变异明显加工过程作用机制先在细胞核，后在细胞质仅在细胞核中大部分作为翻译阻遏子，大部分介导靶mRNAs的小部分导致靶mRNAs降解降解长度保守性22-23nt高21nt更高内容概要miRNA简介miRNA研究的应用领域miRNA研究的技术路线应用领域肿瘤研究疾病治疗植物研究动物研究miRNA干细胞研究病毒研究microRNA与肿瘤研究1）肿瘤发生：MiRNA能够作为肿瘤抑制剂或致癌因子行使功能，特定miRNA的敲除或过表达可用于研究miRNA在癌症发生和发展过程中的作用2）肿瘤诊断：正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明显改变.这些特点使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标3）肿瘤治疗：由于大多数致癌基因能够引发癌症，因而可以设计一些人造miRNA阻碍其表达．从而达到抑制癌症形成的目的。microRNA与人类疾病目前，多种疾病与microRNA的关系已得到了研究，如胃癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、舌鳞癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、心脏病、血液病、脑发育及神经系统疾病、内分泌代谢疾病、炎症反应、免疫反应等。microRNA与干细胞研究miRNAs在干细胞的自我更新、未分化状态的维持、继续分化增殖等都具有重要的调控作用。将miRNAs作用与转录因子调控和表观遗传调控等相结合，有助于全面地了解干细胞自我更新和多向分化潜能的分子机制。miRNA与病毒研究miRNA可以通过与病毒的靶mRNA结合从而灭活RNA病毒；宿主细胞编码miRNA对抗病毒感染的同时,病毒本身的基因组也可以编码自己的miRNA攻击宿主细胞的防御系统。microRNA与植物研究调控植物的生长发育介导植物对病毒、病菌的抗性调节植物对环境的耐受胁迫如抗干旱、抗盐、抗严寒等microRNA与动物研究调控动物的生长发育介导动物细胞的增殖与凋亡调控激素如胰岛素的分泌小结miRNA的作用是多种多样的,它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。大多数miRNA并非独立作用,而是参与到复杂的基因调控网络中。据推测,人类三分之一的mRNA都被miRNA调控,随着它们的作用机理逐步明了,相信将会给人类带来更多的福音。内容概要miRNA简介miRNA研究的应用领域miRNA研究的技术路线miRNA研究的技术路线miRNA的分离纯化miRNA的检测与鉴定miRNA功能研究miRNA分离纯化方法TRNzol，PAGE电泳法离心柱法TRNzol，PAGE电泳法TRNzol法提取totalRNA。PAGE电泳。按片段大小分离miRNA。从PAGE胶中回收纯化核酸。离心柱法提取miRNA样品的处理miRspin吸附miRelute吸附漂洗洗脱样本前处理——离散，均一，细胞集或细胞系液氮研磨植物：100mg动物：30-50mg细胞：107匀浆或液氮研磨应用红细胞裂解液处理蛋白酶K处理离心柱法提取miRNA——天根公司DP501试剂盒miRNA研究的技术路线miRNA的分离纯化miRNA的检测与鉴定miRNA功能研究miRNA检测鉴定方法克隆测序法Northern杂交RT-PCR技术生物信息学基因芯片技术原位杂交技术荧光定量技术克隆测序法先分离纯化小RNA，3’和5’寡核苷酸接头连接进行RT-PCR获得cDNA，连接到载体上构建cDNA文库，筛选克隆进行测序，获得miRNA序列。优点：直接、可靠。缺点：很难克隆出在不同时期表达或只在特定组织或细胞系中表达的miRNA;而且由于克隆方法固有的局限性,也很难捕获表达丰度较低的miRNA；该方法受其他小分子（如siRNA）的影响，易产生假阳性。ABmiRNA克隆流程图15%的变性PAGE，电泳分离并回收小片段RNA3’端加adaptorRT反应15%的变性PAGE，电泳分离并回收小片段RNA3’端加adaptor5’端加adaptor(DNA＋RNA)5’端加adaptor(DNA)pcrTA克隆测序并分析结果RT反应pcrTA克隆测序并分析结果基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱，检测灵敏度较高芯片制作和检测需要昂贵的仪器结果是半定量的，重复性较差不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境，因而不能区分高度类似的miRNANorthern杂交简便可靠，将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测既可用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平，又可结合RNAmarker检测miRNA的分子大小缺点：对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40ug才会出现明显杂交信号原位杂交技术可检测miRNA表达，并直观的展示出miRNA的时空表达模式可在福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织、细胞及亚细胞水平进行miRNA的检测既可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，又可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平RT-PCR技术简洁、快速、特异的检测miRNA的相对含量高通量，可同时检测多种miRNA的表达仅需少量RNA，且不用放射性同位素标记可同时检测到成熟miRNA及其对应的pre-miRNA需确保引物3’端的不同，较高的退火温度（60－61℃）可提高反应特异性，以富集的miRNA为模板扩增可提高检测的灵敏性荧光定量技术高度特异性超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度样品消耗少，仅需1～10ng的总RNA适用范围广，总RNA、细胞裂解物及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测引物、探针设计要求较高OligodT荧光定量技术——引物设计Reverse引物通常为通用引物，Forward引物一般都直接用miRNA序列或为增加其检测的特异性而特殊设计的序列：引物末端加适当的A碱基；引物3‘端去除几个碱基后整理的序列。颈环结构引物生物信息学1）发夹结构是miRNA二级结构的基本特性2）依据miRNA序列和结构的保守性，这是区分miRNA候选基因和其他不相关发夹结构序列的关键因素3）根据发夹结构的动力学稳定性和序列、结构的相似性，或者利用相关已知miRNA的遗传座位进行预测新的miRNA预测软件：MIRscan软件、snarloop软件、RNAz软件序列检索miRNA研究的技术路线miRNA的分离纯化miRNA的检测与鉴定miRNA功能研究miRNA功能研究的方法定点突变异位表达转基因基因芯片计算机预测miRNA靶基因的预测方法Starketal.miRandamiRandamiRBaseTargetScanTargetScanSDIANAmicroTPicTarRNAHybrid依据互补性互补性互补性Seed区互补性Seed区互补性miRNA-靶标复合体热力学稳定性miRNA-靶标复合体热力学稳定性miRNA-靶标复合体热力学稳定性网址://://microrna.sanger.ac.uk://://diana.pcbi.upenn.edu/://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrmiRNA与靶基因的相互作用验证间相互作用的结构学验证间相互作用的功能学验证miRNA／mRNA间相互作用的结构学验证——荧光素酶报告载体系统miRNA／mRNA间相互作用的结构学验证——pulldown策略通过使用针对Argonaute(：Ago)蛋白家族成员(这组蛋白已知与miRNAs结合并与特异性靶mRNAs3‘-UTR区部分互补序列结合)的抗体，可免疫共沉淀Ago蛋白结合的mRNAs。是一种基于它们在体内物理学上的相互作用来鉴定功能性miRNA靶的方法miRNA／mRNA间相互作用的功能学验证——miRNA和靶mRNA的共表达为了抑制生物学的靶基因的表达，miRNA必须和其靶mRNA在同种细胞内共表达。1、通过从一种特异细胞中提取总RNA，用特异性的探针进行Northernblot分析，或用特异性引物进行实时定量RT-PCR检测来证明2、原位RT—PCR方法可直接定位成熟miRNAs及其前体，证明在生理学相关标本中以组织或细胞特异性的方式进行表达。miRNA／mRNA间相互作用的功能学验证——miRNAs对靶基因蛋白表达的影响用miRNA抑制剂来抑制内源性miRNAs的功能，如果miRNA／mRNA间的相互作用是真实的，那么靶基因的表达量应该增加。用针对此蛋白的特异性抗体经Westernblot分析蛋白的表达量。ELISA或免疫细胞化学实验也可用来分析蛋白表达量的差异miRNA／mRNA间相