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HPVDNA检测及质量保障和质量控制报告人：王庆勇人乳头瘤病毒（HPV）HPVDNA检测质量保障和质量控制宫颈癌是世界高发妇科肿瘤，85%发生于发展中国家。人乳头瘤病毒Themostfrequentcancersinwmenworldwide(inthousandsofnewcasesperyear)人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒（HPV）是一类无包膜的小DNA病毒，它们可感染人的皮肤和黏膜上皮组织，引起上皮组织的各种良恶性增生病变。人乳头瘤病毒PercentageofinvasivecervicalcancersattributabletospecificHPVgenotypesAdiagramofthelifecycleofHPVinamucosalsquamousepithelium人乳头瘤病毒2008年10月6日公布HaraldzurHausen获诺贝尔生理学或医学奖。在“诺奖”评审委员会发布的新闻公告中，这样写到：“拉尔德·楚尔·豪森敢于摒弃教条，他所做出的探索性工作，让人类了解了HPV与宫颈癌的关系，促进了针对HPV疫苗的开发”。宫颈癌也由此可能成为人类通过注射疫苗、筛查和早诊早治来预防，并被消除的第一个恶性肿瘤。宫颈癌成为目前癌症中：唯一病因明确唯一可以早期预防和治疗唯一可以彻底根除的癌症HPV的生长具有严格的种属与组织特异性，不能体外培养。减毒活疫苗×L1L2原核表达的L1蛋白免疫后诱导产生的抗血清中和能力较弱，免疫保护力较弱。L1VLPsL1/L2VLPsL1L1L2+真核表达L1单独存在或与L2一起均可以组装成病毒样颗粒（VLP），其形态和免疫原性都与天然病毒类似，但不含病毒基因组DNA。人乳头瘤病毒目前已有的VLP疫苗：HPV16，18，6，11VLPHPV16，18VLP均含HPV16，-18两种高危型安全性、免疫保护活性都很好，检测终点是HPV感染及感染相关的癌前病变。免疫保护反应主要是型别特异性的，交叉保护效果不理想(HPV型别地理位置差异)。HPV-45型在来自非洲西部宫颈癌组织中很常见HPV-52、58型在中国妇女中检测率较高DNA疫苗重组病毒疫苗蛋白疫苗肽疫苗HPV治疗性疫苗人乳头瘤病毒病毒主要转化基因的持续高水平表达是肿瘤细胞恶性表型维持所必需增强策略：改造抗原基因、协同佐剂、融合免疫活性分子人乳头瘤病毒（HPV）HPVDNA检测质量保障和质量控制（聚合酶链反应的发明）•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）•基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪•1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖HPVDNA检测1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍HPVDNA检测PCR的特点•灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌•简便、快速1.一次性加好反应液，2～4小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析•对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAHPVDNA检测HPVDNA检测SummaryofcommoncommerciallyavailablenucleicacidtestsforthedetectionofHPVincervicalsampleofwomen(notcomprehensive)HPVDNA检测SummaryofcommoncommerciallyavailablenucleicacidtestsforthedetectionofHPVincervicalsampleofwomen(notcomprehensive)HPVDNA检测HR-HPV持续感染导致宫颈浸润癌的发生。HR-HPV感染很普遍，大部分为一过性感染，可自动消除。HR-HPV筛查具有高度的灵敏度。HR-HPV检测进行初筛特异性（检出的非致瘤病变所导致的阴道镜过度转诊和过度治疗）没有哪一种癌症筛查检测方法能够检出所有已发或早期宫颈癌病例。HPVDNA检测相对于细胞学检查阴性，HrHPV检测阴性更确保发生CIN3+的风险更低。另外，ATHENA研究显示，HrHPV初筛相比细胞学可多检出50%的CIN3+HPVDNA检测2015ASCCP过渡期筛查指南合理管理hrHPV阳性女性的方法是：对hrHPV阳性者采用HPV16和HPV18基因分型，并结合细胞学对其它12种hrHPV阳性分流。HPVDNA检测HPVDNA检测HPV检测对于宫颈高级别病变具有高度的敏感性和特异性HPV检测操作简单，结果快速，成本效益评价优检测方法具有临床验证敏感度可达85%，阴性预测值达90%以上HPVDNA检测人乳头瘤病毒（HPV）HPVDNA检测质量保障和质量控制设备要求人员要求环境要求质量控制要求数据采集要求质量保障和质量控制设备要求实验室应当具备与检测要求相适宜的仪器设备（包括：检测仪器、试剂及耗材）同时应遵守实验室制定的标准操作规程（SOP）和临床基因扩增实验室管理要求。质量保障和质量控制实验室使用的分析仪器和主要的辅助设备、试剂应有国家食品药品管理局批准和注册的文件。应制定相应的维护和功能检查程序文件，按照厂家要求或实验室建立的方案定期进行校准及维护，并做相应记录。设备及试剂的要求质量保障和质量控制光源样品检测器发射滤光片激发滤光片标本采集容器应采用一次性或无菌容器,保存液符合要求。实验室在选择试剂时要进行验证（说明书上的性能指标）使用不同批号试剂要做平行检测,保证每一批试剂的有效性。设备及试剂的要求质量保障和质量控制临床灵敏度：真正把高度病变的妇女筛出，而不是把病毒检出。分析灵敏度：灵敏度高可减少漏诊，但假阳性（发现过多无临床意义或无风险的HPV阳性妇女）会增多，增加检查费用和不必要的阴道镜和病理检查。特异性：把真正可能会导致妇女发生高度病变的人群筛查出来，尽量不要检测出无临床相关性的病毒水平，增加后续的检查量。关键指标质量保障和质量控制设备及试剂的要求HPVDNA检测所需各种设备、试剂及相应批准文号（三证）。所用物品和（或）试剂是否在保质期内。设备是否定期校准。设备维护、保养记录（日、周、月）。保存液应满足检测要求（2ml5ml10ml20ml）。质控标准质量保障和质量控制设备要求（1）试剂批间差异、耗材的抑制物的验收判断标准：选取5个旧批号检测过的样品，覆盖测量区间（包括阴性、临界值、低值、中值和高值），至少4个样品测量结果偏倚±7.5%，其中阴性和临界值样品必须符合预期。质控标准质量保障和质量控制设备要求（2）设备要求人员要求环境要求质量控制要求数据采集要求质量保障和质量控制人员要求人员资质及配备人员培训质控标准质量保障和质量控制人员资质及配备标本采集人员需具备医学教育背景及相应资质，经过严格的专业培训熟练标本采集，采集标本时应按照取样器上的说明书进行操作质量保障和质量控制人员要求（1）人员资质及配备质量保障和质量控制人员要求检验人员具备相关专业的大专以上学历或具有中级及以上技术职务任职资格两年以上实验室工作经历和临床基因扩增检验实验室技术人员培训上岗证书实验室主任：应有中级以上职称实验室应配备不少于2名以上人员（2）人员培训质量保障和质量控制人员要求应制定并执行针对所有人员的培训计划定期参加内部、外部的培训建立培训档案考核合格方可上岗质控标准质量保障和质量控制人员要求现场观察人员相关资质，是否是机构正式职工或合同制聘用人员培训计划和记录内部培训的问题质量保障和质量控制人员要求人员少，实际上没有内部培训形式没有年度培训计划没有培训记录内部培训的重要性质量保障和质量控制人员要求外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多的是“学习”内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更多的是“思考”内部培训（讲座、自学、练习、咨询、讨论）内部培训（专业理论、其它理论、操作）设备要求人员要求环境要求质量控制要求数据采集要求质量保障和质量控制质量保障和质量控制环境要求实验室应具有检测设备和分析过程正常运行的空间，有良好的通风、照明应遵循《二级生物安全实验室管理要求》根据实验方法和设备的不同，实验室应符合相应设备和操作环境需求。（1）质量保障和质量控制环境要求（2）遵循《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》遵循《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》经过技术审核及上级行政主管部门登记备案后开展HPV检测工作（申报、资料审核、现场验收、整改、结果审核）质量保障和质量控制环境要求（3）分区的实验室,根据不同方法平台进行相应分区。原则上应设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区和扩增产物分析区温度湿度符合设备仪器要求，一般要求温度在15-30℃，湿度为30-80%。质量保障和质量控制环境要求产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的PCR实验室设计A质量保障和质量控制环境要求产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区理想的PCR实验室设计B质量保障和质量控制环境要求试剂准备区标本制备区扩增及产物分析区门门门空气流向空气流向空气流向门质控标准现场观察：执业许可备案登记（执业副本）环境安静，空间充足。实验区有效物理分隔及限制性标识实验室温度、湿度记录，冰箱温度控制记录实验室清洁、遗撒物处理、紫外灯消毒记录质量保障和质量控制环境要求设备要求人员要求环境要求质量控制要求数据采集要求质量保障和质量控制质量控制要求样本的质量要求检测质量要求检验报告签发分子诊断项目分析性能标准质量保障和质量控制样本的质量要求样本容器一次性HPV采集管样本接收样本应有明确、清晰的标识并确保标识的唯一性进行二次分注的样本应可追溯到原始样本标本与申请单相关信息是否一致质量保障和质量控制质量控制要求样本的质量要求质量保障和质量控制质量控制要求样本拒收申请单填写字迹潦草或有疑问时液基细胞样本不足1ml样本转移至二级导管其体积不足1ml不适宜检测的其他情况（血液）样本的质量要求质量保障和质量控制质量控制要求样品处置待测样本从冰箱取出，放置到生物安全柜至少平衡30分钟至室温如果需将样本转移至二级导管，先将样本充分混匀且保证体积为1ml样本的质量要求质量保障和质量控制质量控制要求样品保存根据实验方法的不同，采用相应的条件保存标本制定检测后样本（原始样品、核酸提取物和/或核酸扩增产物）保留期限和保存条件，以备复检使用。质量控制要求样本的质量要求检测质量要求检验报告签发分子诊断项目分析性能标准质量保障和质量控制检测质量要求室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)•由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。•可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。质量保障和质量控制质量控制要求（1）检测质量要求室内质量控制实验室根据厂家说明