中文操作手册-核内因子染色

BD核内因子染色流程本流程适用于562574试剂套装562574套装的组分:组分容量Lot.NoTFFix/PermBuffer(4X)25ml(1ea)51-9008100TFDiluentBuffer75ml(1ea)51-9008101TFPerm/WashBuffer(5X)150ml(1ea)51-9008102试剂准备：•配制工作液之前，缓慢颠倒混匀5次以下试剂：BDPharmingen™TFFix/PermBuffer(4X),TFDiluentBuffer以及TFPerm/WashBuffer(5X)。•制备1xFix/Perm工作液：用TFDiluentBuffer3：1稀释4xFix/PermBuffer。每个样本通常需要1ml1xFix/Perm工作液。如20个样本需5ml4xFix/PermBuffer和15mlTFDiluentBuffer）。1xFix/Perm工作液配好后，尽量在1小时之内用完。•制备1xPerm/Wash工作液：用去离子水4：1稀释5xPerm/WashBuffer，每个样本需要7.5ml1xPerm/Wash工作液。如20个样本需30ml5xPerm/WashBuffer和120ml去离子水）。1xPerm/WashBuffer可在2-8°C保存一周。•胞内染色过程中所有工作液需置于冰上或2-8°C。表面染色：用100μlBDPharmingen™StainBuffer(FBS)(货号：554656)或StainBuffer(BSA)(货号：554657)制备单细胞悬液（10^6细胞），每管依说明书加入适量的细胞表面荧光抗体（如CD4，CD8，CD25或CD19等），2-8°C避光孵育30分钟。随后加2mlstainbuffer清洗细胞，继续如下胞内染色的步骤。胞内转录因子染色：1.固定/破膜：表面染色之后，吸去多余的stainbuffer（货号：554656或554657）。振荡混匀细胞，随后加入1ml新鲜配制的1xFix/PermBuffer工作液，振荡混匀3s。2-8°C避光孵育40-50分钟。2.破膜/清洗：直接向已固定破膜的细胞中加入1ml1xPerm/WashBuffer。350g，2-8°C离心6分钟。弃上清。3.破膜/清洗：加入2ml1xPerm/WashBuffer，350g，2-8°C离心6分钟。弃上清。4.胞内染色：80-100μl1xPerm/WashBuffer重悬细胞，向管中加入适量特异性胞内因子抗体（如FoxP3,T-bet和/或IL-17A）或非特异性对照（如Ig同型对照），涡旋振荡10s以充分混匀，2-8°C避光孵育40-50分钟。5.破膜/清洗：清洗前轻轻振荡混匀样本。加入2ml1xPerm/WashBuffer，350g，2-8°C离心6分钟。弃上清。6.破膜/清洗：加入2ml1xPerm/WashBuffer，350g，2-8°C离心6分钟。弃上清。7.流式细胞仪样本准备：350μlstainbuffer重悬细胞，上流式细胞仪检测并分析数据。