14基因诊断与基因治疗

1第二十一章基因诊断与基因治疗2第一节基因诊断一、基因诊断的含义基因诊断（genediagnosis）亦称分子诊断、DNA诊断。采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。3二、基因诊断的原理及方法1基因诊断的原理检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常2基因诊断的方法（1）DNA诊断（2）RNA诊断4（1）DNA诊断1）限制性片段长度多态性2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe）3）单链构象多态性（SSCP）4）DNA序列分析（2）RNA诊断1）RNA印迹（Northernblot）2)RT-PCR51）限制性片段长度多态性—基因连锁分析（1）方法原理：待测DNA序列中的点突变导致了某一限制性内切酶识别位点的改变可引起其特异的限制性内切酶片段的大小与多少随之改变，即而通过Southern印迹杂交和限制性内切酶酶谱分析诊断出点突变。66（2）诊断原理在人群中，个体间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA多态性可以改变限制性内切酶的切割位点，产生DNA限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。77RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一种致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种遗传性标志来判断家族成员或胎儿的基因组中是否携带致病基因。8899（2）应用Asickle-cellanemia的基因诊断a.病因血红蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸。10101234561111b.检测限制性内切酶：Sau1酶切位点：CCTNAGG探针：标记的β珠蛋白1212c.结果分析切割正常待测血红蛋白β珠蛋白，DNA与探针杂交后产生1.1kb切割异常待测血红蛋白β珠蛋白，DNA与探针杂交后产生1.3kb131314141515（1）原理根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于突变基因异常核苷酸序列的寡核苷酸作为杂交探针，从而直接检测和鉴定突变基因。2）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）1616相应于突变基因异常相应于正常基因核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷杂交探针酸杂交探针与受检者DNA进行分子杂交发生杂交均可杂交与异常不发生杂交(突变纯和子）（杂和子）与正常发生杂交(正常纯和子）171718181）病因H-ras（化学诱导）ras家族K-ras编码P21蛋白N-ras（自然发生)ras家族点突变好发于12、13、61位密码子（2）应用—大肠癌K-ras的基因诊断19192）检测a、PCR扩增用人工合成的位于待测点突变两侧的引物，分别扩增含12、13、及61位点的基因片段。2020b、ASO分析①将扩增产物结合在尼龙膜上分别与ras原癌基因密码子12、13、61所有可能引起碱基突变的寡核苷酸探针进行杂交；②杂交后，膜经严格的洗涤，仅允许完全相配的杂交双链存在；③针结合处在光胶片上呈阳性斑点2122223）mRNA的检测（1）原理通过对mRNA进行定量、检测其剪接加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能否转录、转录物（mRNA）是否正常以及转录效率的高低。2323*mRNA不稳定可将其转为cDNA再用PCR技术进行研究（RT-PCR）2424（2）应用视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷Rb1基因的mRNA全长4.7kb采用RT-PCR技术分析外显子突变或mRNA前体剪接异常。2525分析外显子19至22间的基因突变逆转录引物：外显子22反义链序列5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3`PCR引物:外显子22正义链序列5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`外显子19正义链序列5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2626用RT-PCR检测艾滋病27三、基因诊断的应用1.遗传疾病的诊断产前诊断、遗传病易感性2感染性疾病（1）病毒性感染（2）细菌性感染（3）寄生虫（4）其他283恶性肿瘤4法医学中应用29（1）DNA指纹分析（DNAfingerprinting）可变串联重复序列小卫星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）30（2）短串联重复（shorttandemrepeat,STR）多态性分析微卫星DNASTR—PCR31第二节基因治疗的基本概念和基本策略一基因治疗（genetherapy）的概念1、背景与历史疾病的分子生物学了解新技术新方法（特别是重组DNA）的迅速发展321989年5月28日第一个基因标记计划（TIL-NeoR）1990年9月11日第一个基因治疗计划（ADA-SCID）331995年NIH组织Orkin、Motoksy对头5年基因治疗评估3点建议：•发展载体技术•疾病的分子机制•动物模型成立3个国家实验室2000年2月532个计划，3400余个病人•34病种：恶性肿瘤62.2%遗传性疾病13.3%AIDS6.8%心血管疾病6.8%其他1.3%352、定义基因角度：正常或有功能的基因置换或增补缺陷基因。治疗角度：新的遗传物转移到某个体获治疗效果。363、方式基因矫正和置换:同源重组基因增补:ADA、血友病基因封闭:myc基因过度表达，反义抑制活化前体药物基因治疗：37单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因导入肿瘤细胞合成HSV-TK无毒性的抗病毒有毒性的抗病毒药物（GCV）药物（GCV三磷酸）细胞死亡384、导入方式exvivo基因转移invivo基因转移39第三节基因治疗的条件1、目的基因的种类：细胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受体基因401、目的基因的获得方法1）真核基因组DNA文库中目的基因的克隆2）cDNA文库中目的基因的克隆3）人工合成基因片段4）PCR法筛选扩增目的基因411、外源基因的要求1）含信号肽的cDNA，序列正确2）必要的调控元件（顺式作用元件启动子、增强子、静止子）423）外源基因进入细胞核转录，再转移至细胞浆，间隔序列（内含子），剪接信号（SA,SD）PolyA信号，核内转录因子4）翻译的起始密码子、终止密码子、内核糖体进入位点（IRES）元件5）外源基因的丢失、失活、甲基化434、基因治疗的靶细胞（targetcell）1）生殖细胞全世界受严格控制2）体细胞选择的标准：A、容易取出和移植B、容易体外培养C、目的基因高效导入D、细胞寿命长44常用靶细胞；自体、同种异体、异种、淋巴、骨髓、皮肤、肝、肌、肿瘤细胞等4546基因导入的方式：exvivo——体外将基因导入targetcell,然后将此修饰过的细胞回输给病人。Invivo——外源基因直接导入体内有关的组织器官。47•3、基因导入（转移）的工具与方法。将外源基因或DNA片断导入宿主细胞进行扩增或表达，需要有一个能在该宿主细胞进行复制和表达的载体（vector）来携带。前者与后者在体外构成重组DNA分子，然后导入宿主细胞。481）非病毒方法4950（一）磷酸钙转染技术磷酸钙--DNA导入细胞吞噬体转运细胞器瞬时稳定外源基因存在外源基因非特异于染色体DNA外与宿主染色体DNA重组12小时内表达持续约3-4天降解稳定转化细胞株51（二）DEAE-葡聚糖转染技术（略）52（三）脂质体转染法（20%）聚阳离子脂质体-DNA脂质体DNA阳离子复合物负电荷的细胞膜吸收此复合物（融合吸收）优点：简便、低毒性、无免疫原性、无病毒产生、化学成分已知可大量商业供应缺点：转染效率低，短暂表达53（四）电穿孔转染技术靶细胞（悬浮态）+外源目的DNA电穿孔仪高压电脉冲靶细胞膜发生瞬时可逆性破裂形成微孔外源目的DNA进入靶细胞54（五）基因枪技术电子发射装置或高压气流金或钨颗粒包裹外源目的DNA形成“子弹”打入靶细胞55上述物理、化学方法转移基因的缺点：1）转移效率低，多应用于实验研究2）维持时间短2、病毒方法56在以基因治疗为目的的载体系统中，以病毒载体最为常用，其优点：1）易于改造与操作2）转移效率高3）较高的靶细胞特异性57病毒载体：逆转录病毒(retrovirus)载体————用于具有分裂功能的细胞中进行基因转移与表达58腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性细胞中进行基因转移与表达59（六）逆转录病毒载体1、逆转录病毒的结构由2条相同的38S单链RNA组成2、逆转录病毒的生活周期606162感染宿主细胞病毒基因组的整和原病毒DNA的转录与翻译••逆转录病毒颗粒的释放633、原病毒DNA的结构特点64654、逆转录病毒载体的构建66675、包装细胞系的构建1）没有包装细胞，逆转录病毒载体就不能装配成假病毒颗粒感染靶细胞，完成外源基因的高效转移682）去除莫洛尼氏小鼠5’端含有包装信号ψ一段序列辅助病毒整和NIH3T3染色体形成包装细胞系转录编码病毒结构基因携带外源基因的逆不能包装成病毒颗粒转录病毒载体（含有包装信号）导入该细胞系提供病毒结构基因提供包装信号包装成仅含有外源目的基因假病毒696、逆转录病毒-包装细胞系的特点1）感染增殖分裂的细胞2）转移效率高3）有效整和、传代4）宿主范围广（七）腺病毒载体1、腺病毒载体的结构7071723、腺病毒载体的特点1）可感染非增殖分裂的细胞2）易于培养与储存3）非整和4）可致免疫反应（八）质粒DNA直接注射73基因治疗的基本过程74靶基因+载体————重组DNA分子—————靶细胞————病人75举例：细胞因子修饰肿瘤细胞降低其致瘤性提高其免疫原性761、靶基因：细胞因子（α-TNF,IL-2,γ-IFN,等）2载体：逆转录病毒ψLTRgagpolenvLTR77逆转录病毒载体PLN系列：ψLTRNEOLTR783、包装细胞：PA317,包装为病毒4、感染靶细胞5、在靶细胞中表达基因产物79基因治疗的安全性问题:2次事故靶向性、效、基因整合位点、表达调控80基因敲除（knockout）与基因添加（knockin）遗传工程生物中，一个正常基因可被几种方式所改变方法1：正常基因完全被基因的突变拷贝所替换可以在没有正常基因的干扰下提供突变基因活性的信息81方法2正常基因彻底失活应用于获得正常基因在整体生物中的可能功能的信息方法3一个突变基因加入到基因组最易进行的遗传工程8283转基因动物的概念用实验方法把外源基因导入动物的受精卵，再将这一受精卵接种到借腹怀孕的寄养雌性动物（fostermother）的子宫内，使之发育繁殖，这时外源基因与动物本身的基因组整合，外源基因就能随细胞分裂而增殖，再体内表达，并传给下一代，这样生育的动物称为转基因动物8485小鼠基因置换过程的总结8687动物药厂的基本概念88