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第十六章基因诊断GeneDiagnosis基因诊断—以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程第一节基因诊断的技术方法一、基因诊断中常用的分子生物学方法㈠核酸分子杂交㈡PCR㈢SSCP（PCR-SSCP）㈣限制酶酶谱分析㈤DNA序列测定㈥DNA芯片技术㈠核酸分子杂交制备样品制备探针杂交检测获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件杂交双链的稳定程度主要由Tm值决定，影响Tm值的因素包括：1.双链的碱基组成、长度、碱基错配程度2.溶液离子强度3.变性剂的影响在无变性剂存在的情况下，最适杂交发生在比DNA/DNATm低20～25℃，比DNA/RNATm低10～15℃㈡PCR一般与其它技术合用㈢单链构象多态性（SSCP）检测PCR-SSCP由于检测点突变㈣限制酶酶谱分析基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变㈤DNA序列测定㈥DNA芯片技术二、基因诊断的基本方法基因变异致病的类型：1.内源基因的变异基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位基因表达异常mRNA剪接异常2.外源基因的插入㈠基因突变的诊断1.点突变的诊断①诊断已知的点突变（PCR/ASO）一对探针突变碱基置探针中央控制杂交条件结果分析：反向杂交技术基因芯片技术：可检测出新的突变类型②诊断未知的突变PCR/SSCP/测序DNA芯片技术针对不同的点突变可采用的方法1.PCR和限制酶酶解2.PCR/ASOH3.等位基因特异的PCR4.变性梯度凝胶电泳5.PCR/SSCP6.PCR/双脱氧指纹法（DDF）7.PCR/测序2.少数核苷酸缺失或插入的诊断3.大片段丢失或插入的诊断PCR/多重PCR4.基因重排（染色体易位）的诊断5.基因扩增的诊断㈡多态性连锁分析DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism）DNA多态性标记1.RFLP2.短串联重复序列（shorttandomrepeat,STR）3.单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）1.限制性片段长度多态性（RFLP）DNA→酶切→Southern杂交分析DNA→PCR→酶切→电泳分析2.由串联重复顺序导致的长度多态性STR含有较高的信息量且容易检测STR由2~6个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA㈢基因表达异常的诊断1.mRNA的相对定量分析斑点杂交或狭缝杂交RT—PCR2.mRNA的绝对定量分析RT—PCR/竞争性PCR3.mRNA长度分析Northern杂交/RT—PCR产物电泳㈣外源DNA检测核酸分子杂交PCR技术第二节遗传病的基因诊断一、遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断点突变2.间接诊断多态性连锁分析镰刀型红细胞贫血症：第六位密码由GAG突变成GTG第三节感染性疾病的基因诊断一、感染性疾病基因诊断的策略1.针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交2.应用PCR技术扩增病原体基因保守序列3.核酸杂交技术与PCR技术联合应用第四节肿瘤的基因诊断一、肿瘤基因诊断的策略1.检测肿瘤相关基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因2.检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌—EB，宫颈癌—HPV3.检测肿瘤标志物基因或mRNA肝癌—甲胎蛋白（AFP）结肠癌—癌胚抗原（CEA）二、肿瘤相关基因的检测㈠ras癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变检测方法：1.PCR/ASO2.PCR-SSCP㈡p53的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290检测方法：1.PCR—SSCP2.PCR—测序3.PCR—RFLP㈢其它基因的检测PCR结合其它技术基因芯片第五节基因诊断在法医学上的应用DNA指纹Southrenblot