基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45bp，我们建议引物长度为30~35bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。（2）如果设定的引物长度为30bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。（5）最好使用经过纯化的引物。Tm值计算公式：Tm=0.41×(%ofGC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；%ofGC：引物GC含量。四、引物设计实例以GCG→ACG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30bp长的上下游引物，并将A(T)设计在引物的中央位置。Primer#1:5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer#2:5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。（3）重新调整引物长度。Primer#1:5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’Primer#2:5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。五、突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GCbuffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。六、如何去掉PCR产物最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。七、如何拿到质粒直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。八、图示九、定点突变操作步骤[A]诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。1.设计点突变引物。[注]参考引物设计指导2.准备模板质粒DNA[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。3.[选项]对照反应体系（50μl反应体系）10×ReactionBuffer5μlpUC18controlplasmid（10ng/μl，total20ng）2μlControlprimermix（20pmol/μl）2μldNTPmixture（each2.5mM）2μldH2O38μlMuta-direct™Enzyme1μl4.样品反应体系（50μl反应体系）10×ReactionBuffer5μlSampleplasmid（10ng/μl，total20ng）2μlSampleprimer(F)（10pmol/μl）1μlSampleprimer(R)（10pmol/μl）1μldNTPmixture（each2.5mM）2μldH2O38μlMuta-direct™Enzyme1μl5.PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。CyclesTemperatureReactionTime1cycle95℃30sec15cycle95℃30sec55℃1min72℃1minperplasmidKb6.PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。[注]按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。MutationCycles1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles[B]突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。1.准备PCR反应产物2.加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。[C]转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。1.将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。2.接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？对于第一个问题：怎么设计引物？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物要加上一个原则：一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12basepair。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个basepair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个basepair，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG960现有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG924***********************************************************|----deletionX71661.1AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT1020现有序列AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT984（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后