基因型鉴定

基因型鉴定PCRprotocol1.剪取2mm趾甲或尾端放入离心管中。2.裂解鼠尾a.鼠尾裂解法：每个样品中加入200μl鼠尾裂解液+5μl蛋白酶，56℃过夜，实验前98℃金属浴10min，立即放入冰盒中冷却。（鼠尾裂解液：0.5％SDS、0.1MNaCl、0.05MEDTA、0.01MTris.C1(pH8.0)）b.强碱裂解法：向样品中加入100μl50mMNaOH，96℃金属浴10min，在金属浴中冷却至40℃左右（增加裂解效率），然后自然冷却至室温；向裂解液中加入20μl1MTris(PH8.0)5mMEDTA后涡旋5sec，中和强碱。3.WT和KO鼠PCR体系（20μl）Mix10μl（使用EasyTapPCRmix）R/FPrimer各0.4μlSample2μlddHO27.2μl注备：由于分样时损失，先配制2n+2管量的（Mix+ddHO2），均匀分为两份，分别加入n+1的R和F引物，在分配到8连管中（17.9μl/孔），然后加入样品。或使用10μl反应体系，各种试剂使用量减半。4.PCR反应程序Syt7（Public–SYT7）：变性：94℃2min变性：94℃30sec退火：60℃40sec延伸：72℃35sec72℃10min5.跑胶鉴定向TBST中加入1%琼脂糖，混匀后，在微波炉中加热约2min。（大板需要配胶60ml，小板25ml）。冷却后，加入EB（按1：10万加），混匀后倒胶，室温下冷却后，放入电泳槽中，点样，10μl/孔。打开电泳仪电源，接好电极（红对红，黑对黑），电压设置约165V，跑胶15分钟左右。在凝胶仪中照胶，鉴定基因型。30循环Sty1（Sty1—genotyping）变性：95℃3min变性：95℃30sec退火：55℃30sec延伸：72℃35sec延伸：72℃4min28个循环