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王琴中国兽医药品监察所010-61255400wq551@vip.sina.com猪瘟诊断与净化技术研究猪瘟诊断与净化技术研究一、猪瘟病原学诊断方法研究二、猪瘟抗体检测方法研究三、猪瘟防控及净化技术研究一、猪瘟病原学诊断方法研究猪瘟病原学诊断方法的原则诊断方法必须达到特异、敏感、快速、重复性好、结果易判定的标准；早期确诊，避免传播风险；持续感染呈现的非典型临床表现和病理变化，需要灵敏的检测方法；全面的疫苗防控政策，需要鉴别感染猪与免疫猪；与其它相关猪病的混合感染，也需要建立鉴别诊断技术。必须依赖实验室诊断方法，提升诊断水平一、猪瘟病原学诊断方法研究经典方法动物接种试验（该方法很少使用）病毒分离技术√荧光抗体检测技术(FAT)/免疫过氧化物酶检测技术(IPT)√抗原捕获-ELISA√分子诊断技术RT-PCR技术（诊断和基因分型）√实时荧光定量RT-PCR技术(欧盟猪瘟参考实验室诊断标准)√恒温扩增技术（NASBA，LAMP）原位杂交技术（ISH）基因芯片技术猪瘟病原不同诊断方法的比较方法标志物特点病毒分离法感染性病毒原金标准；周期长；实验室生物安全要求高，不适合全群普查。FAT/IPT蛋白抗原组织感染细胞集中。抗原ELISA蛋白抗原慢性感染血液感染细胞数少；敏感性较低。FQ-PCR/RT-PCR病毒核酸不论病毒是否完整都能检测；RNA提取困难。1.猪瘟病毒分离技术+病毒分离法依然是猪瘟诊断的金标准，特异性为99%，较抗原检测ELISA方法敏感性高，但是较分子诊断技术的敏感性差，用于确诊；+特异单抗的使用能提高病毒分离法的特异性和准确性，还能与瘟病毒鉴别；+分离的病毒可用于基因分型及分子流行病学调查等进一步的研究。▬细胞准备和病毒繁殖时间较长（3-10天），费时费力；▬昂贵的细胞培养设施；▬由于样本污染或抗体原因，也可能分离失败；▬技术性较强，实验室生物安全要求高。2.荧光抗体检测技术(Fluorescentantibodytest，FAT)/免疫过氧化物酶检测技术(Immunoperoxidasetest，IPT)FAT和IPT是非常有价值的诊断方法，活体检测可采用扁桃体；病死猪可采用各种淋巴组织、消化道（回肠）、咽喉粘膜、脾、肾、胰脏和皮肤等被广泛染色，且信号强。+快速，2小时即可得到结果；+特异，依据采用的荧光抗体（多抗或单抗)；+检测病毒蛋白的抗原，感染的细胞比较集中，直接观察、直观。－但是需要有经验的操作人员；－高度依赖抗体的特异性；－在观察组织片时有时背景不清晰。FAT阴性结果不能完全排除CSF感染。北美洲和拉丁美洲则常使用免疫过氧化物酶单层试验（Immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA）2.荧光抗体检测技术(FAT)/免疫过氧化物酶检测技术(IPT)切片法：易观察，周期长，无法用筛查。涂片法：判断难度大，快速，2小时即可得到结果。猪瘟单抗在标记技术（FAT/IPT）中的应用针对多克隆抗体特异性差的缺陷，自主研发了猪瘟病毒E2特异单抗，优化了猪瘟病毒FAT/IPT，增强了特异性和准确性。采用该单抗作为一抗，应用商品化标记辣根过氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了猪瘟病毒免疫过氧化物酶细胞单层试验染色方法。对该单抗直接进行荧光素标记，建立了猪瘟单抗免疫荧光技术,该技术尤其适用于田间种猪的扁桃体带毒筛查及临床诊断，简单、快速、准确，错判误判率大大减少，易推广。能鉴别检测BVDV病毒。采用该单抗建立的FAT/IPT，可用于CSFV分离鉴定、毒价测定和细胞中和实验。3.抗原-ELISA（抗原捕捉-ELISA）检测材料：全血、血清、组织悬液等。+快速，4～16小时+容易商业化，价廉+容易操作+自动化程度高－敏感性和特异性较病毒分离、免疫标记法、RT-PCR低；－在发病病程中，诊断时间短，仅检测到病毒血症期间的病原。合适群体检测，不合适个体筛查。4.建立了系列猪瘟荧光定量RT-PCR技术猪瘟病毒通用荧光RT-PCR诊断试剂盒：该试剂盒对非典型无临床症状的持续感染CSF的诊断可提供一个快速、敏感、准确的方法。获国家专利（ZL200610109404.X），成为我国猪瘟病毒核酸检测的第一个国家标准（GB/T27540-2011）。猪瘟病毒MGB鉴别荧光RT-PCR诊断试剂盒：解决了CSFV鉴别诊断难题，对我国猪瘟净化提供了准确可靠的鉴别诊断技术，获得国家专利（ZL200910242080.0）猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒：对HCLV中间产品的效价进行评价，代替传统兔热反应方法，能更准确指导疫苗定量配苗，缩短生产周期，节约成本，产生更明显的经济效益。获得专利受理。牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒：可用于HCLV原材料（血清和牛睾丸细胞）中BVDV核酸检测，为HCLV质量安全提供技术保障；也可用于猪和牛BVDV感染的检测。获得专利受理。标准化的猪瘟病毒RT-nPCR检测方法：对研究CSFV遗传变异规律，掌握流行现状；溯源和追踪每一起疫情；监测疫苗有效性，提出新的防控策略具有十分重要的科学意义。采用该方法进行猪瘟诊断和分子流行病学监测，具有一举两得的双重效应。核酸检测技术材料:血(白细胞,血清)、组织提取液+检测感染性RNA,或RNA片段+快速，3-5小时+较其他方法敏感+可实现高通量检测+特异性强，可鉴别BVDV+可定量▬由于污染可引起假阳性结果▬由于RNA提取的损失导致假阴性结果▬需要进行专业的技术培训大多数实验室均采用自建的方法，需要统一评价。猪瘟荧光定量RT-PCR技术对持续感染CSF的检测TaqMan-MGBPCRRT-nPCRtotalpositivenegativepositive10414negative0510510total10514524样品处理是瓶颈:液体样品如血液等只需澄清固体样品如扁桃体、淋巴结、回肠、脾脏、胰腺、肾脏等，需研磨或捣碎.结缔组织等有韧性，最好是研磨.Throughput:glassgrindermicro-homogenizerGenogrinder样品处理用器材微型匀浆器捣碎机96samp/5min实现高通量检测（RNA病毒）二、猪瘟抗体检测方法研究通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证，也是评价疫苗免疫效果的重要技术手段。对于已经消灭猪瘟并且实施非免疫策略的国家，如加拿大、美国和欧洲部分国家，常常通过抗体ELISA方法进行病原监测追踪和流行病学调查，血清学阳性猪被认为存在猪瘟的感染。因此，CSFV抗体检测技术已成为猪瘟的诊断和预防控制、血清学调查、流行病学研究和疫苗免疫效果评价的关键技术。病毒中和实验体外病毒中和试验（Virusneutralizationtest,VNT）荧光抗体病毒中和试验（NIF）（国际贸易指定试验）√过氧化物酶联中和试验（NPLA）（国际贸易指定试验）√体内病毒中和试验猪瘟病毒兔体中和试验√猪瘟病毒猪体中和试验酶联免疫吸附试验（ELISA）间接ELISA（国际贸易指定试验）√阻断ELISA（国际贸易指定试验）√其它常规和新型诊断方法猪瘟正相间接血凝试验（IHA）猪瘟抗体免疫金标快速检测试验琼脂扩散试验（AGP）免疫芯片技术二、猪瘟抗体检测方法研究目前存在的问题？为什么种猪免疫监测不合格？养猪场十分重视猪瘟的免疫，80%以上猪群均注射过兔化弱毒疫苗，种猪几乎是100%免疫。一些猪场免疫监测结果表明，猪群免疫平均合格率只有55.7%。种猪78.6%左右，仔猪%74.2%，育肥猪71.36。免疫可靠的合格率：种母猪应为90-95%以上，种公猪和后备猪应为100%的合格率。国外抗体检测试剂盒占领我国市场大约70%份额，价格昂贵。因此开发国产化的准确、特异、敏感和简便的系列CSF诊断试剂盒，是解决当前我国CSF防控和净化的重要和关键技术，也是实施《规划》的重要技术保障，具有十分重要的意义。荧光抗体病毒中和试验（Neutralization-immunofluorescence，NIF）NIF是国际公认检测猪瘟抗体最可靠的方法，称为“金标准”。定量猪瘟病毒加不同稀释度的被检血清，置适当条件感作后接种于敏感细胞，并用猪瘟荧光抗体（单克隆抗体能增强其特异性）染色检查有无荧光斑的出现，以测定被检血清阻止培养细胞发生病毒感染的能力及效价。欧洲一些实验室使用猪瘟强毒（Alfort/187）（1.1）进行本实验，效果良好。然而也正是因为使用强毒株作试验病毒，因此该法的推广在一定程度上受到了限制，具有散毒的风险。我室目前使用标准Thiverval（1.1）株进行该实验，十分安全和稳定。过氧化物酶联中和试验（Neutralizationperoxidase-linkedantibody，NPLA）该技术的原理与荧光抗体病毒中和试验（FAVN）相同，只是检测试验结果时所用的染色方法不同，利用抗猪IgG-HRPO结合物与底物显色来判断被检血清中有无猪瘟抗体的存在及其效价。该技术的优点是可用肉眼判定结果，同样，该法也是国家贸易指定试验之一。FAVN和NPLA都是抗体检测的“金标准”，可用于实验室确诊和鉴定。NIF和NPLA+NIF和NPLA是检测猪瘟抗体的确认方法，称为“金标准”。+特异性强+敏感性高+能定量，10ND50被认为是抗体阳性━FAVN和NPLA技术涉及细胞培养、病毒繁殖及抗体染色等，实验周期长（8-10天），成本高。━需要有经验的实验人员，劳动强度大。━生物安全实验室的要求高。━不适用于规模化的抗体普查。━与BVDV有交叉反应，采用猪瘟单抗可以鉴别BVDV,增加特异性和准确性。体内病毒中和试验猪瘟病毒兔体中和试验：利用工作浓度的猪瘟兔化弱毒抗原，与不同稀释度的被检血清等量混合作用后，耳静脉注射家兔，据家兔体温反应结果定性定量判定被检血清。此法作为检测猪瘟抗体的经典方法，仍是检测结果的确诊方法，但该实验方法耗时，受试验动物体等因素的影响大。猪瘟病毒猪体中和试验：应用易感仔猪进行中和实验，是检测猪瘟抗体最敏感的方法，该方法1963年由英国AHVLA研制。但实验中所用猪瘟病毒中有无致病性细菌、被检血清中有无抗菌抗体等都会对实验产生重要影响,易发生误诊。采用本动物需增加相应的隔离设施，工作量和费用都必然增加，易造成猪瘟病毒的散播。目前该方法基本不用。其它常规诊断方法猪瘟正相间接血凝试验:方法简单，适应于基层,特异性和敏感性校差；稳定性有待于提高。琼脂扩散试验:特异性和敏感性低，目前已经不再使用。猪瘟抗体免疫金标快速检测试验特异性好，操作简便、快速，全程只需5min左右，不需特殊仪器设备，肉眼直接观察和判断检测结果，适用于临床检测。一般作为定性，不易定量，大批量的检测样品时不如ELISA快速方便。目前市场上已有猪瘟抗体胶体金试剂盒销售，产品质量参差不齐，没有经过权威机构评价。免疫芯片技术：所需标本量少，检测信息量大，快速，自动化程度高。但成本高，目前还没有相应的产品。荧光微球技术：我们正与KSU合作，展示了良好的应用前景酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）Engvall和Perlman(1971）首次建立的。由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化和规模化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。随着技术的创新、材料的不断更新。采用基因工程方法制备包被抗原（可溶性抗原的表达），可提高其敏感性和特异性；采用针对某一抗原表位的单抗研制的阻断ELISA，可提高其特异性；电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用于传染病学普查和诊断的方法之一。酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）在我国，ELISA技术已成为监测免疫后猪瘟抗体水平、评价免疫效果的最主要手段。通过该方法来