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食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告一、食品中菌落总数的测定1、菌落总数定义：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数。2、菌落总数测定的意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品储存期限的长短。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。是食品检验工必需具有的基本操作技能！3、菌落总数测定的方法平板活菌计数法即倾注平板法4、平板活菌计数法步骤图示检验步骤(程序)：检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果报告结果：单位（cfu/mL,g）1个菌体代表1个单细胞！及时计数！菌落总数测定注意事项培养（一般食品）36±1℃培养48±2h；（水产品）30±1℃培养72±3h；如果样品中可能含有培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基，约4mL，凝固后倒置培养。第四节食品卫生大肠菌群检验技术一、大肠菌群什么是大肠菌群？在一定培养条件下（37℃，24h）能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属（阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）、克雷伯氏菌属中的一部分和沙门氏菌属的第Ⅲ亚属的细菌。菌属代表种致病性埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)急性腹泻枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系统、创伤感染，败血症等阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)引起原发性感染1、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因:1)在粪便中数量最大（30亿个/g）；2)有来源特异性，仅来自人和温血动物肠道；3)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；4)检测方法简便容易。二、大肠菌群的测定意义3、大肠菌群的测定意义（1）判断食品中否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。三、大肠菌群的生物学特性1、形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌。2、发酵乳糖：产酸产气3、培养特性：在ＥＭＢ琼脂上的典型菌落：呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。革兰氏染色EMB平板麦康凯琼脂平板表1粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征培养基菌落特征伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽；紫黑色、不带或略带光泽；淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽；深红色、不带或略带金属光泽；淡红色、中心较深。中国兰平板深蓝色；浅蓝色；中心深蓝色麦康凯平板桃红色；粉红色、中心桃红色大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基--COLIID用于在37℃下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定四、大肠菌群检验方法及操作方法国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)行业标准：两步法：推测试验→证实试验检样稀释与乳糖胆盐发酵试验1、大肠杆菌的检验步骤图示分离培养证实试验(乳糖发酵试验)检样稀释处理革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽孢产气革兰氏阳性大肠杆菌阴性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管（36±1）℃，（24±2）h产气不产气大肠杆菌阴性报告报告大肠杆菌阳性伊红美蓝琼脂平板（36±1）℃，（24±2）h旧国家标准GB/T4789.3报告检样稀释处理BGLB肉汤（36±1）℃，（48±2）h产气大肠杆菌阴性报告不产气LST肉汤管（36±1）℃，（48±2）h产气不产气报告大肠杆菌阳性新国家标准GB/T4789.3LST:月桂基硫酸盐胰蛋白胨BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤LST肉汤管乳糖发酵管大肠菌群的报告MPN法简介MostProbableNumber因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可按概率理论计算菌数。MPN法是一种基于泊松分布来估算细菌浓度的方法。目前，我国仍普遍将MPN法用于大肠菌群，大肠杆菌等的检测。大肠菌群最可能数（MPN）的报告确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽孢杆菌。1、粪大肠菌群的检验步骤检样稀释44℃乳糖胆盐发酵产酸产气45℃EC肉汤发酵产酸产气革兰氏染色EMB分离查MPN表报告产酸产气►从制备样品匀液至稀释完毕全过程不得超过15min。►对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。►挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。►不可用其他胆盐代替指定的胆盐。检验注意事项