XXXX年湖北省结核病防治研究所实验室诊断(鲁进)

结核病实验室诊断湖北省结核病防治研究所周丽平2013年8月鲁进上传，以供学习结核分枝杆菌是结核病的致病因子与确诊依据，结核病实验室诊断就是用直接或间接的方法来证明患者体内存在结核分枝杆菌。在临床患者样本中寻找结核分枝杆菌也就是实验室检测的主要内容。理想的诊断技术应该具有快速、特异、敏感、准确简便和价格低廉的特点，这也是结核界近百年来技术研究的方向。目前结核病实验室检查主要有：结核病的细菌学诊断（涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定）结核病的免疫学诊断（皮肤结核菌素试验、结核抗体测定、结核抗原测定、细胞因子检测）结核病分子生物学检测（DNA探针技术、PCR测序、PCR定性检测结核分枝杆菌、双重实时荧光PCR技术和TaqMan探针技术及等温扩增技术），目前分子生物学检测技术发展非常快。结核病病理学诊断。根据国家和我省的“十二五”结核病防治规划，要求100％的地（市）级结核病实验室具备药物敏感性试验能力、100％的区（县）级实验室具备分枝杆菌培养能力，同时根据我省“三位一体”工作开展的实际情况，目前我省各级开展结核病诊断的实验室在涂片、培养、药敏实验方面能力还显不足。因此主要从细菌学诊断给大家做些介绍，同时简介目前我国正在评估和推广应用的新诊断技术。抗酸菌涂片涂片制备每一张玻片都要编号涂抹痰标本自然干燥加热固定使用铅笔在磨砂面上编号使用竹木签进行涂抹不得使用火焰加热的方法加速痰膜干燥加热固定涂片太厚适宜太薄痰膜的厚薄好脱落好不均匀适宜太厚太薄涂片厚度挑取了痰标本的脓性部分做螺旋状轨迹涂抹均匀大小约为2cmX1cm不要太厚透过染色前的痰膜可以隐约看到报纸上的字好的涂片Ziehl-Neelsen染色过程1.初染(碱性复红)2.脱色(盐酸酒精)3.复染(亚甲兰)抗酸菌非抗酸菌碱性复红脱色Z－N染色原理－4复染染色过程将涂片排放在染色架上滴加碱性复红染色液，加热出现蒸汽后，保持5分钟流水轻缓冲洗滴加脱色液，保持1分钟流水轻缓冲洗滴加亚甲兰复染液，保持1分钟流水轻缓冲洗将涂片排放在染色架上，注意间隔滴加碱性复红加热流水冲洗脱色-流水轻缓冲洗复染流水洗去复染液在玻片架上自然干燥涂片抗酸染色检查方法Z－N染色步骤操作流程涂痰膜自然干燥复红加热初染5分钟自然干燥镜检流水冲洗美兰复染30秒5%盐酸酒精脱色1-3分钟流水冲洗流水冲洗荧光染色0.1%金胺“O”染液染色10分钟，水洗；3%的盐酸酒精脱色1-2分钟，直至无黄色可见，水洗；0.5%高锰酸钾溶液复染1-2分钟，水洗，晾干。检测用10倍目镜，40倍物镜，不加油。显微镜读片检查及结果报告单一的抗酸菌“V”-字形成簇的抗酸菌复染太浓造成的影响适宜的复染萋尼氏法镜检结果报告标准阴性未发现抗酸菌/300视野报告实际菌落数1-8条/300视野(1+)3-9条/100视野(2+)1-9条/l0视野(3+)1-9条/每视野(4+)达到或超过10条/每视野报告1+至少观察300视野，2+至少观察100视野，3+以上至少50个视野荧光法镜检结果报告标准阴性未发现抗酸菌/50视野报告实际菌落数1-9条/50视野(1+)10-49条/50视野(2+)1-9条/每视野(3+)10-99条/每视野(4+)达到或超过100条/每视野报告2+至少观察50视野，3+以上至少20个视野分枝杆菌培养操作步骤对照标记的患者姓名，在生物安全柜内将约2ml痰标本置于相应的前处理管中；使用吸管，将与痰标本等体积4%NaOH加入前处理管中；旋紧处理管螺旋盖，接通涡旋振荡器电源，将处理管在涡旋振荡器上涡旋震荡30秒左右；如果以手持拿处理管，持拿方法是以拇指、无名指分别持拿处理管外壁，食指、中指按处理管螺旋盖。操作步骤将前处理管置于试管架内，置于生物安全柜内，室温静置15分钟；拧开罗氏培养管螺旋盖，检查培养基斜面底部的凝固水，如果凝固水过多，则沿着斜面相对的一面的培养管内壁，将凝固水弃去。以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，吸取时吸取的程度要小于挤压的程度，使吸管前端一段不含液体，避免液体意外滴落。操作步骤保持培养基斜面水平或底端略高，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基使用接种2滴（约0.1-0.15ml），接种时第一滴液体接种至斜面中部，第二滴接种到培养基上部；将用过的吸管置于废液缸内；旋上培养管螺旋盖，不要太紧；轻轻转动并放低培养管底部，使接种的液体均匀的在斜面上铺开。培养基置于恒温培养箱内，36±1℃孵育；操作痰标本1－2倍4%NaOH振荡匀化静置15分钟37℃竖直培养8周均匀接种0.1ml,2支/标本斜面向上，37℃水平放置24小时接种和孵育培养流程图涡旋振荡1-2分钟痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH分别接种0.1ml前处理液至2只培养基斜面接种后3天、7天观察，此后每周观察一次置37℃温箱培养有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性室温静置15分钟4325671登记与报告接种后第3和7日观察培养情况，此后每周观察一次，直至第八周末。每次观察后要在培养结果记录本上记录观察结果。无菌落生长报告培养阴性菌落生长不及斜面面积1/4时报告实际菌落数菌落占斜面面积1/4报告(1+)菌落占斜面面积1/2报告(2+)菌落占斜面面积3/4报告(3+)菌落布满培养基斜面报告(4+)初步判定、报告以药物敏感性测试为目的（包括耐药性诊断和耐药监测等），不需要对培养物进行涂片检查，只需将培养物送至进行药物敏感性测试的实验室，并附培养物生长情况的报告单。以培养作为诊断或评价疗效为目的，需要对培养物进行涂片显微镜检查、鉴定，根据涂片和鉴定结果进行报告。培养物经涂片显微镜检查确定为抗酸菌后，结合菌落形态、生长时间，报告：罗氏培养抗酸菌阳性经菌种初步鉴定，证实为结核分枝杆菌复合群后，报告：罗氏培养结核菌阳性菌落形态1、幼稚菌落比较小，表面光滑而有光泽呈黄色；成熟典型菌一般为中等大小或较大，干燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黄色，不透明凸起菌落。2、不典型菌落为细小、园形、湿润、易乳化、呈黄红色，一般7-10天内就成熟，常为非典型抗酸杆菌或非致病菌。如果发现培养基污染，按污染面积报告污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/4报告(C1+)污染菌有明显界限，且不超过斜面面积1/2报告(C2+)污染菌有明显界限，且不超过斜面面积3/4报告(C3+)污染菌没有明显界限或布满培养基斜面报告(C4+)注意事项留取标本后，尽可能立即进行培养。如果不能立即处理，应冷藏；将氢氧化钠分装成若干小瓶（小包装），每次使用新的氢氧化钠；如果只有一台生物安全柜，避免同时进行涂片和培养操作；在同一批处理的痰标本中，优先处理涂片阴性的标本，其次处理阳性级别低的标本，最后处理涂片阳性级别高的标本打开标本容器盖子时要缓慢以减少气溶胶的产生，同时避免剧烈震荡标本，震荡后静置几分钟，然后再打开盖子注意事项处理标本时，尽可能随时盖上容器盖子，避免在生物安全柜内敞开所有的标本容器用过的无菌吸管应置于废液缸中；正确标记培养管避免标本之间混淆；控制前处理去污染的接触时间，从向标本中加入氢氧化钠到接种时间不能超过20分钟，为此，当标本数量较多时，应分批处理，每批标本数量不超过6份为宜；注意事项应将培养结果及时反馈给临床医生。7天以内的结果观察中如果发现污染，应告知病人及时收集另一份标本；如果发现快速生长分枝杆菌（7天内长出的菌落）。立即报告结果并要求再收集另一份痰标本。结核菌可能在3-4周内生长。发现菌落并鉴定后立即报告结果。报告阴性培养结果时应孵育满8周。登记内容应包括：菌落初生长的日期以及阳性培养物的菌落特征;污染结果应随时检出并报告。常用的评价指标涂阳培阴率=培养阴性的病例总数/涂片检查阳性的病例总数*100%涂阳培阴率应10%污染率=污染的培养管数量/培养管总数*100%污染率应5%可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。标本选择不当选择标本中脓样、干酪样可疑部分过处理（时间、浓度)4％NaOH，1－2倍体积，20分钟接种量太小每管接种0.1毫升温箱温度不当温箱内置温度计，每日监测温度。涂阳培阴率过高？可能原因解决方法标本保存不当(时间、温度）标本留取后尽快培养，暂时无法培养应于4C冰箱保存。前处理不充分4％，1－2倍，充分混旋，20分钟。材料灭菌不佳接种用吸管需高压灭菌。操作不当培训，预培养，严格按操作规程操作。培养基因素统一供应，4C直立保存，1个月内使用污染率过高？药敏试验目的：治疗，监测，诊断耐药主要就是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。比例法Canetti,1963临界药物浓度（单和多药物浓度）临界菌群比＝耐药菌群数/全菌群数1%、10%…绝对浓度法Meisnner，1963临界药物浓度（单或多药物浓度）临界药物菌落数（10、20菌落）比率法Mitchson，1963RR=MIC被检菌/MICH37Rv常见几种法：比例法药敏试验的基本步骤含药培养基的制备菌液制备和稀释接种培养报告结果推荐浓度（ug/ml)药物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960异烟肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0链霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星401.01.0卷须霉素4010.010.01.252.5环丙沙星3.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫异烟胺5.010.02.55.0丙硫异烟胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0环丝氨酸40NRNRNRNR氨硫脲NRNRNRNRNR利奈唑胺1.01.0WHO推荐的DST培养基药物浓度(2007)药敏实验实验前物品准备所有实验用品必须无菌所有用品一次性拿入实验室，不要在实验过程中反复进出实验室试验菌株的准备一、临床标本初分离的菌株，若具备以下特点，可直接用于药敏试验：1、出现肉眼可见菌落后1－2周的新鲜菌落。2、没有其他污染菌共存。3、涂片确认为抗酸菌二、以下情况需要二次传代后才能进行药敏试验：1、固体培养基上生长老化的菌落。2、固体培养基上部分污染的菌落。药敏实验实验人员的安全防护：分枝杆菌药敏试验是对高致病性病原微生物的纯分离培养物进行操作，实验室实验人员进入药敏试验区须穿防护服、鞋套，实验中须戴手套、帽子、N95口罩。菌悬液制备准备磨菌瓶或磨菌管：磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶，装入约10个直径3mm的玻璃珠，高压灭菌后待用。磨菌管为底部磨砂的玻璃管，带有与之匹配的磨砂玻璃棰（磨菌棒），分别高压后方可可使用。菌悬液制备磨菌瓶法：在磨菌瓶中加入1~2滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。注意尽可能刮取多处的菌落。旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上混旋0.5-1分钟。加入少许灭菌的PBS或生理盐水。将悬浊液转移至比浊管中，加生理盐水或PBS其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarlandNo.1）一致，即得到1mg/ml的菌液。菌悬液制备磨菌管法向磨菌管中加入1滴10%吐温-80，用火焰消毒的接种环刮取2-3周的新鲜菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动，使呈乳酪样，加入少许灭菌PBS缓冲液或生理盐水，静止片刻，吸适量（1-2ml）至比浊管中，加入生理盐水直至其浊度与标准麦氏比浊管（MacFarlandNo.1）一致，即为1mg/ml的菌液。取菌磨菌菌液稀释每株菌事先准备好2个稀释管，然后用22SWG标准接种环或微量吸管吸取比浊好的菌液，无菌操作逐步稀释至10-2mg/ml和