细胞化学染色

细胞化学染色检验申家辉1一、概述二、细胞化学染色的基本方法三、临床应用21、概念：细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门科学，以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质（包括酶类、脂类、蛋白质、糖类、铁、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。3一、概述2.细胞化学染色的目的（1）辅助判断急性白血病的类型（2）辅助血液系统等疾病的诊断与鉴别诊断3.细胞化学染色的基本步骤：包括固定、显色反应、复染。（1）固定：为了保持细胞结构及化学成分的稳定性而选用的方法。根据染色的目的，最常用的固定剂有甲醛、甲醇、乙醇等。5（2）显色：通过不同的化学反应，最终形成稳定的有色沉淀，使被监测的化学物质显示出来。包括偶氮偶联法：如NAP、ACP及各种脂酶染色普鲁氏蓝反应：如铁染色雪夫（shiff）反应：如PAS染色联苯胺法：如POX染色（3）复染：使各种目的细胞能显示出来更便于观察6过氧化物酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色糖原染色非特异性酯酶染色特异性酯酶染色骨髓铁染色7二、细胞化学染色的基本方法1、原理：poxH2O2O联苯胺联苯胺蓝+亚硝基铁氰化钠8蓝黑色颗粒（一)过氧化物酶(POX)染色2.试剂(1)联苯胺酒精溶液：取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml,再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。(2)稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加30%H2O21滴。（3）瑞吉氏复染液93、染色方法1、新鲜干燥涂片加联苯胺酒精溶液10滴，覆盖整个髓膜，固定1-2min。2、再加等量的稀H2O2，混匀后染色4－5min,勿倒去染液直接流水冲洗。3、瑞氏染液复染。104、注意事项（1）H2O2要新鲜配制，注意有效性（2）标本要新鲜，最长不超过一周，时间长了酶活性减弱。（3）POX染色后，一定要冲洗干净，否则染料堆积或浮于表面，影响瑞氏染色结果观察。115、结果判定：中性粒细胞杆状及分叶核呈强阳性是染色成功的标志(设对照片）。在细胞的胞浆中出现蓝绿色或蓝棕色颗粒为阳性反应。121.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.晚幼红细胞，呈阴性；3.单核细胞，呈弱阳性；4.浆细胞，呈阴性14急性粒细胞白血病（M2a)的POX染色原始粒细胞均呈阳性急性淋巴细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；其他原始淋巴细胞均呈阴性急性早幼粒细胞白血病的POX染色１.原始红细胞，呈阴性；其他早幼粒细胞均呈强阳性急性单核细胞白血病的POX染色1.中性成熟粒细胞，呈强阳性；2.原始单核细胞，呈阳性；3.原始单核细胞，呈弱阳性；其他原幼单核细胞呈阴性6、临床意义（1）正常分布粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈不同程度阳性。单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。19（2）急性白血病的鉴别诊断幼稚细胞POX阳性率≥3%：急非淋（AML)幼稚细胞POX阳性率＜3%：急淋（ALL)20（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色（偶氮偶联法）1.原理磷酸奈酚钠磷酸+萘酚偶联萘酚+重氮盐不溶性有色沉淀物定位于胞浆(坚固蓝RR盐)21NAPPH9.2～9.8222.试剂（1）固定剂：10％甲醛甲醇溶液（2）Tris-Hcl缓冲液的配制：Tris粉〔三胺基甲烷〕4.85克溶于200ml蒸馏水中,加浓HCL1-2滴，PH调至9.2，4℃保存！（3）作用(基质液):磷酸萘酚钠5mgN-N二甲基酰胺1mlTris-Hcl液4ml坚固蓝RR盐5mg（4）复染液：1%中性红3.操作步骤1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干；2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干；3、1%中性红复染1min234.注意事项(1)重氮盐以坚固蓝RR盐为最佳；(2)坚固蓝RR盐应适量：过多易造成染色失败，过少使反应减弱；(3)每次都要做阳性对照；(4)作用液新鲜配制，配好后要立即使用245.结果观察:(对照片成熟中性粒细胞中出现棕黑色颗粒为阳性细胞，说明染色成功)正常人除成熟中性粒细胞NAP可见阳性外，其它血细胞均为阴性。且正常阳性率＜40%，积分值30～130分。256.NAP阳性结果及积分判断标准“－”0分，胞浆中无阳性颗粒“+”1分，胞浆中含有少量颗粒“2+”2分，胞浆中含有中等量颗粒“3+”3分，胞浆中含有丰富的颗粒，但胞核清楚“4+”4分，胞浆中含有丰富粗大的颗粒，但胞核不清楚中性粒细胞碱性磷酸酶染色1.中性成熟粒细胞（+）；2.中性成熟粒细胞（++）；3.中性成熟粒细胞（+++）；4.中性成熟粒细胞（++++）；5.淋巴细胞（-）2829NAP分级7.临床意义增高：细菌感染、类白、AA、急淋、慢粒急变、骨髓增殖性疾病，恶性淋巴瘤。降低：慢粒、急粒、PNH、MDS、恶组308.鉴别诊断慢粒与类白：前↓；后↑。PNH与AA：前↓；后↑。急粒与急淋：前↓；后↑。MDS与慢性再障：前↓；后↑。病毒感染与细菌感染：前者无明显变化，后者↑。恶组与反应性组织细胞增多：前↓；后↑。31（三）酯酶染色概述特异性酯酶染色非特异性酯酶染色概述根据各类细胞所含酯酶特异性高低分为特异性酯酶(SE)和非特异性酯酶(NSE)；特异性酯酶是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）；非特异性酯酶根据水解基质液的PH不同，又分为中性NSE（α-醋酸萘酚酯酶），酸性NSE（酸性α-醋酸萘酚酯酶），碱性NSE（α-丁酸萘酚酯酶）。目前常用的是氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NAS-DCE和α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）+NaF抑制试验。1.原理（偶氮偶联法）氯乙酸AS－D萘酚AS－D萘酚+重氮盐(坚固蓝B盐)34NAS-DCE不溶性有色沉淀物定位于胞浆内酶所在位特异性酯酶(CE)染色基质液基质液2.试剂：（1）固定液：10％甲醛甲醇溶液（2）作用液（基质液）氯乙酸AS－D萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液19ml坚固蓝B盐10mg（3）复染液：1%中性红353.染色方法（1）固定：10%甲醛甲醇液固定30秒，水洗晾干（2）滴加作用液37℃孵育30min，水洗（3）1%中性红复染1min，水洗晾干镜检。364.注意事项：1.氯乙酸AS-D萘酚溶液应避光，4℃冰箱保存，变黄或混浊即失效。2.染色温度37℃效果最好375.结果判断中性分叶核粒细胞胞浆中见细小，弥漫分布的蓝色颗粒为染色成功的标志。6.临床意义粒系除早期原粒外，其余阶段细胞均为阳性，其它各系均为阴性。CE染色对粒细胞白血病有特异性的诊断价值。3839CE非特异性酯酶染色（α-NAE）1.原理：α-醋酸萘酚α-萘酚重氮盐40α-NAE形成不溶性有色沉淀定位于胞浆内酶所在位置7.4~7.6(坚固盐B)2.试剂（1）固定液：甲醛（2）作用液:α-醋酸萘酚5mg丙酮5-8ml磷酸盐缓冲液10ml固蓝B盐10mg（3）复染液：10g/L甲基绿水溶液41423.染色步骤（1）甲醛蒸气固定5-10min，流水冲洗5min晾干（2）放入作用液37℃1h,流水冲洗。（3）10g/L的甲基绿溶液复染5min,水洗待干镜检（4）NaF抑制试验：在40ml作用液中加NaF15mg同样染色后，油镜计数100个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率和积分，按公式计算出抑制率，正常小于50%。A图：急性单核细胞白血病α-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性B图：急性单核细胞白血病α-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）AB4.结果判断：胞浆内有棕色或棕黑色沉淀物为阳性染色成功指标：正常部分原始、幼稚及成熟单核细胞呈阳性；部分粒细胞为弱阳性反应；部分成熟淋巴或个别中、晚幼红呈阳性。44455.临床意义：鉴别急性白血病（1）急单时，原始至成熟单核大多为α-NAE阳性，且易被NaF抑制，抑制率正常大于50%。（2）急粒时，白血病细胞多呈阴性或弱阳性，M3呈阳性，但均不被NaF抑制。酯酶双染：同一张血涂片上的细胞分别在两种不同的基质液中作用一定时间，复染镜检。主用于鉴别诊断AML-M4亚型。46骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。（四）糖原染色(PAS)细胞内糖原中的乙二醇基48氧化过碘酸二醛基1.原理（过碘酸-雪夫氏反应）二醛基经过加成和缩合使无色亚硫酸品红恢复品红的红色失去亚硫酸定位于含有糖原的细胞内2.试剂（1）10g/L的过碘酸氧化剂⑵雪夫氏试剂（schiff）：红色品红与偏重亚硫酸钠，变成了无色品红。⑶20/L甲基绿复染液493.操作（1）新鲜髓片放在95％乙醇中固定10分钟；蒸馏水冲洗待干；（2）10g/L过碘酸氧化15分钟；蒸馏水冲洗；（3）置雪夫氏试剂浸泡45分钟，水洗后凉干；（4）甲基绿复染15分钟，水洗待干镜检。504.注意事项（1）所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。（2）雪夫氏染液应避光密封保存，变红则失效。（3）放入雪夫氏溶液之前，用蒸馏水洗涂片，而且一定要完全干燥，若有水，试剂变色失效。51（4）染色时间和温度应相对恒定，一般37℃效果最好。（5）染好的标本不能久放，8天后渐退色，因此应及时观察。525.结果观察阳性：细胞浆内的红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状，胞核染绿色。阴性：胞浆无色或无红色颗粒。536.临床意义正常血细胞的染色反应（1）粒系：原始细胞多为阴性，随着细胞成熟，阳性逐渐增强。（2）淋系：正常人阳性率10-50%之间，多为20%以下。（3）红系：PAS呈阴性反应（4）巨核：PAS呈阳性反应（5）单核系:呈阴性或细颗粒状弱阳性。54正常血细胞PAS染色1.原始粒细胞（-）2.早幼粒细胞（+）3.中性中幼粒细胞（++）4.中性晚幼粒细胞（+++）5.中性杆状核粒细胞（++++）6.中性分叶核粒细胞（++++）7.嗜碱性粒细胞（+++）8.嗜酸性粒细胞（+++）9.单核细胞（±）10.淋巴细胞（++++）疾病鉴别（1）红细胞系统疾病：M6、MDS呈阳性（均匀或块状红色）；巨幼贫、再障呈阴性。（2）白血病：急淋及慢淋：粗颗粒或块状阳性急粒：阴性或弱阳性（弥散细颗粒）急单：阳性，多为细颗粒有时可见粗颗粒急性巨核细胞白血病：阳性（块状）56PASAML-M6幼红细胞呈阳性反应MA幼红细胞呈阴性反应急性淋巴细胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性59急淋PAS阳性细胞60PAS阳性的幼红细胞1.原理(普鲁氏蓝反应)4Fe3++K4[Fe(CN)6]Fe4[Fe(CN)6]3+12K+(亚铁氰化钾)(蓝色亚铁氰化铁)61（六）骨髓铁染色稀盐酸细胞外铁：主要存在于骨髓小粒的巨噬细胞中细胞内铁：主要存在于有核红细胞中2.试剂（1）固定液：甲醇（2）酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾5份，浓盐酸1份。取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓慢加入浓盐酸，边滴边摇由开始的白色沉淀消失为至。（3）复染剂：0.5%沙黄623.操作步骤（1）选片做标记，甲醇固定10min（2）37℃滴加酸性亚铁氰化钾溶液染色30min（3）蒸馏水冲洗2min后沙黄复染1min，待干镜检。634.注意事项（1）所用的玻片及器具必须清洁，无铁污染。（2）应选有骨髓小粒的髓片做铁染色，以便观察细胞外铁。（3）作用液必须新鲜配制。（4）亚铁氰化钾暴露于空气中，易氧化变质，贮于棕色瓶中，避光密封保存。64（5）复染前应充分冲洗，否则铁粒状结晶过多，影响观察。（6）计数时要不停地旋转细螺旋器，因为铁粒在细胞内的高低度不一致，每看一个中、晚幼红细胞要旋转几次，直到看清为止。（7）观察内铁时，幼红及淋巴细胞要分清，幼红细胞核为鲜红色，淋巴细胞核为淡红色，（8）与污染铁的鉴别：污染铁不在髓小粒和细胞内，而是浮在上边，而且蓝中带黑。655.结果观察：（1）正常幼红细胞核呈鲜红、浆淡黄、铁颗粒呈蓝绿色（2）低倍镜观察细胞外铁：涂片尾部和髓小粒附近阴性：无蓝绿色铁粒。阳性：含有不同程度的铁粒、铁