凯氏定氮法测定食品中蛋白质

课程名称食品理化检测技术授课班级营养1431授课时间2016.4.15授课时数2本次内容食品中蛋白质含量测定教具多媒体教学目标能力（技能）目标知识目标1.能安装凯氏定氮法的消化、蒸馏吸收装置。2.能根据结果判定食品标准。1.了解蛋白质测定意义2.掌握常量凯氏定氮法测定蛋白质方法3.了解试验中各种试剂作用重点蛋白质测定原理、步骤难点蒸馏、吸收装置的安装能力训练方式方法讲解、问答、互动教学环节时间安排复习：5min；讲解、互动：75min小结：5min；看书巩固知识点：5min课外任务对比微量和常量凯氏定氮法实验试剂、步骤的区别课堂考勤47参考资料《食品分析与检验技术》《食品理化检测技术》凯氏定氮法测定食品中蛋白质3一、概述蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以一定方式结合，并具有一定的空间结构。生命的物质基础遗传信息的表达方式人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质维持酸碱平衡、水平衡维持物质的代谢及运转营养指标、食品生产工艺指标。生理功能及在食品中的作用5常见食物中蛋白质的含量牛肉螺旋藻6常见食物氮系数氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。7蛋白质测定方法方法时间应用范围优缺点凯氏定氮法8-10h0.2-1.0mg氮时间长双缩脲法20-30min1-10mg氮灵敏度低、快速检测Folin－酚试剂法40-60min5mg氮灵敏度高、耗时长、试剂配制困难紫外吸收法考马斯亮蓝法5-10min5-15min50-100mg蛋白质0～0.1mg/mL层析柱流出物检测较好，标准曲线有轻微非线性二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。1.原理1样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出2样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵3加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸溶液滴定消化蒸馏吸收、滴定计算2.实验步骤第一步：样品消化样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中对原子的前处理，使被测物质进入溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解为可溶性无机物消化11（1）消化总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（98%）消化装置“自动回流消化仪”定氮消化的不同状态RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清消泡碳化消化过程中试剂作用硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；硫酸铜（蓝绿色）：催化作用442422KHSOSOHSOK褐色22442422242422424022222SOHCuSOSOHSOCuCOSOSOCuCuSOCOSOSOCuCuSO(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二步——蒸馏01氢氧化钠需过量、若不够，会生成H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红02防止样液中氨气逸出。注意事项：(3）吸收与滴定吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液滴定：盐酸标准溶液，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。33427424274243334225)(5)(42BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH18各步骤操作细节图解：样品消化→蒸馏→滴定（1）样品消化样品+0.4g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗19（2）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂2～3d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。20吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源21（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。22实验注意事项—消化（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化（2）消化至呈透明后，继续消化30分钟，一般消化时间约4小时（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂（4）样品不易澄清时可冷却后加入30%过氧化氢2-3ml小结2425自动凯氏定氮仪法在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。仪器：消化炉自动蒸馏装置261、原理及适用范围2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。双缩脲法（分光光度法）1.原理——双缩脲反应碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配合物的反应。肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此反应。560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。27KOH、CuSO4、酒石酸钾钠配置标准曲线标准曲线（standardcurve）是指通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性质的数值曲线。R0.999方可使用2.标准曲线绘制（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止1h；（4）取上清液在2000r/min离心5min、560nm测定吸光度，绘制标准曲线。最终测定溶液中不能有沉淀3.样品测定样品含量需在40-100mg内。4.结果计算（mg/100g）301100mmX燃烧法