实验四 食品中细菌菌落总数的测定

食品微生物学检验菌落总数的测定(GB4789.2—2010)一、目的1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。二、原理细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数。1、菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以CFU/g（mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，36±1℃培养48±2h，能在平板计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。2、细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL样品中的细菌总数来表示。三、材料1、食品检样2、培养基平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液3、其它无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。四、流程1、检样2、做几个适当倍数的稀释液3、选择2~3个适宜稀释度各1mL,分别加入灭菌平皿内4、平皿内倾注15～20mL琼脂培养基，混匀5、36±1℃培养48±2小时或（24±2）小时6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量7、计算菌落总数→报告五、步骤(一)取样、稀释和培养1、以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1～2min，制成1:10的均匀稀释液。2、用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。3、另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。5、稀释液移入平皿后，将冷却至46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀。6、待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，水产品30±1℃温箱内培养72±3h。如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固后培养。（二）菌落记录方法做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4℃，但不要超过24h。1、平皿菌落数的选择选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿，大于300的可记为多不可计。2、其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。3、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。（三）菌落总数的计算1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x1062、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；nl―第一个适宜稀释度平板数；n2―第二个适宜稀释度平板数；d―稀释因子（第一稀释度）。例如：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000（第二稀释度）菌落数232，24433，35232+244+33+35(2+0.1×2)×10-2=544/0.022=24727四舍五入表示为:2.5×104试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x1063、若所有稀释度的平板菌落数均300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x1064、若所有稀释度平板菌落数均30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。5、若所有稀释度平板均无菌落生长，则应按1乘以最低稀释倍数计算。试样例次稀释度选定计数稀释度菌量/(个/g或mL)10-210-310-41平均菌落数380521810-35.2x10425262053210-3，10-42.6x10534352104810-3，10-43.5x10542841523710-2，10-39.0x10452612510-22.6x1036无法计数56831210-43.1x1066、若所有稀释度均不在30～300之间，有的300，有的又30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（四）菌落计数报告方法1、菌落数在1～100时，按四舍五入报告两位有效数字。2、菌落数≥100时，第三位数字按四舍五入计算，取前面两位有效数字，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。注意事项1、无菌操作操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。2、采样的代表性如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。3、稀释液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。5、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。6、倾注培养基的量规定不一，从12～20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。7、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。8、培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。9、为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。六、结果1、将实验测出的样品数据以表格的方式报告。2、对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。报告方式样品稀释液及菌落数选择稀释度报告(CFU/g,ml)10-210-310-4样品名称原始数据计算公式报告平均七、思考1、什么是细菌菌落总数（cfu）？2、影响杂菌总数准确性的因素有哪些？3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌菌落总数为指标？4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在46±1℃的温度？酱油（GB/T2717-2003）：细菌菌落总数：≤30000CFU/mL大肠菌群：≤30MPN/100mL肠道致病菌：不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：特级一级二级细菌菌落总数：≤20000≤30000≤50000（CFU/ml）大肠菌群≤40≤90≤90（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：≤30000CFU/mL大肠菌群：≤90MPN/100mL肠道致病菌：不得检出生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：≤100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出《瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》(GB17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：≤20大肠菌群MPN/100ml：≤3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出