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《食品安全与卫生学》实验设计（专业）分组号:设计者:参与者:时间:实验一“鲜肉的质量评价”综合实验设计内容：以市售鸡肉样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、肉品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（pH计测定酸度、硫酸铜法测球蛋白）、微生物检验（大肠菌群国标法1/试管法）、兽药的免疫学快速检测（环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。一、鸡肉的取样方法：先将检样进行表面消毒（沸水内烫3s—5s，或烧灼消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1︰10稀释液二、鸡肉的感官检验：原理：肉在发生腐败变质时，会发生改变色泽，气味和硬度的现象，并形成气味。方法：1，视觉检查：自然光线下，观察肉的表面形态和色泽，以及有无血块、霉斑污染物，然后用刀顺肉纤维方向切开，观察断面色泽。2，嗅觉检查：常温下嗅其气味。3，硬度检测：在食指按压肉表面，触感其硬度指压凹陷恢复速度，或是否恢复。表面干湿及是否发粘。三、鸡肉的理化检验：制备肉浸液：肉样表层或深层取20-30g肉，除去脂肪和筋腱，切碎。称取10g碎肉放于250mL烧杯中，加入预煮蒸馏水（无氨蒸馏水）100mL，静置30min，每隔5min用玻璃棒搅拌一次，然后用滤纸过滤至100mL的三角瓶中备用。1、pH计测定酸度原理：肉类腐败是，蛋白质分解成氨和胺等碱性物质，使肉的酸度降低，肉的pH值变化在色泽粘度弹性其他评定结果肌肉有光泽。红色均匀，脂肪洁白或淡黄外表微干或微湿润，或有风干膜，不粘手指压后凹陷立即恢复一级鲜度肌肉色稍暗，切面尚有光泽，新切面湿润外表干燥或粘手指压后凹陷恢复慢且不能立即恢复稍有氨味或酸味二级鲜度脂肪呈灰色，切面深灰色、浅绿色表面高度干燥，指压粘手指压凹陷不恢复肉品表面到深层都有腐败气味腐败肉一定程度上反映了肉的新鲜度。1.仪器与药品：天平，刀，250mL，烧杯，100mL三角瓶，100mL量筒，10mL烧杯，温度计，脱脂棉，酸度计，pH缓冲液。2.方法：用酸度计测定肉浸液的pH值。评定标准：鲜肉：5.9-6.5次鲜肉：6.6-6.7腐败肉：6.7以上2、球蛋白沉淀试验原理：肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度随pH值升高而增大在肉的腐败过程中，pH值升高。蛋白质在碱性溶液中能与重金属离子形成沉淀。因此，可根据形成沉淀的情况判断肉的新鲜度。（1）仪器与药品：10%的硫酸铜溶液肉浸液的制备：将肉羊捣碎，混匀，称取10.0g于锥形瓶内，加入100mL蒸馏水，摇匀，浸渍30min，过滤即得到待测肉浸液。（2）测定：在一支5mL试管中加入2mL肉浸液，在另一支试管中加入2mL蒸馏水作为对照。然后分别加入5滴10%硫酸铜溶液，充分振荡后观察。（3）判断：试管中液体呈淡蓝色，并且透明，是新鲜肉，液体轻度浑浊或少量混悬物为次鲜肉，液体浑浊并有白色沉淀为变质。四、微生物检验：操作步骤：（1）.样品的准备：1.称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min----10000r/min均质1min----2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min---2min，制成1：10的样品溶液。2.样品匀液的pH值应在6.5---7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL盐酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（吸管不要触及稀释液面），，振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。4.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全程不得超过15min。（2）初发酵试验每个样品，选择3个适宜的稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管桂基硫酸盐蛋白胨肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL则用双料LST肉汤），36℃培养24h，管擦倒管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵实验，如未产气则继续培养至48h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。（3）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃培养48h。观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。五、环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法1材料与方法1.1试剂CPFX,纯度大于99.7%;CPFX单克隆抗体,包被抗原(OVACPFX);联苯二胺(POD),牛血清白蛋白(BSA),;酶标羊抗小鼠IgG;乙腈、三乙胺;其他试剂为国产分析纯。1.2CPFX标准溶液配制CPFX标准品储液:CPFX标准品5mg,用0.03mol/LNaOH溶液溶解并稀释成1g/L的储备液,置2～8℃冰箱中保CPFX标准品工作液:准确量取适量CPFX标准储备液,用乙腈稀释成适宜浓度的标准工作溶液。1.3样品前处分别取鸡的腿部肌肉组织2g,用少量磷酸盐缓冲液(pH7.0)研磨至匀浆,每个样品均添加CPFX标准品溶液,并设定1.25×10-3、6.25×10-4、3.125×10-4、1.5625×10-4g/kg4个添加水平,另设一个空白。用磷酸盐缓冲液振荡混合,离心,定容至25mL成为备用液[。取备用液用正己烷脱脂作为ELISA检测的试样溶液[;取备用液用SPE小柱萃取作为HPLC检测的试样溶液。.1.4ELISA方法检测样品中的CPFX1.4.1间接竞争ELISA方法的建立[4]包被抗原(OVA-CPFX)用包被液(pH9.6,0.05mol/L碳酸盐缓冲液)稀释至1mg/L加入酶标板,每孔100μL,37℃反应2h;用洗液(pH7.4,0.01mol/LPBSTween20)洗3次,每次3min。将腹水单抗18000倍稀释与适当梯度稀释的标准CPFX溶液各50μL同时加入酶标板内,37℃反应1h;洗板3次后,加入4000倍稀释的酶标二抗,每孔100μL,37℃反应1h;洗板4次后,加底物溶液(OPD)每孔100μL,37℃反应15min,加终止液(2mol/LH2SO4),每孔50μL,通过酶标仪测定D490值。1.4.2ELISA标准曲线的制作准确量取适量CPFX标准品储液,分别稀释成400、200、100、50、25、12.5、6.25、0�g/L的CPFX标准溶液,按1.4.1的方法进行ELISA,以标准品浓度的常用对数为横坐标,以抑制率(A标/A0)%为纵坐标绘制标准曲线。做标准曲线的同时,在一块包被好的酶标板,随机选择10个孔做零标准品间接竞争ELISA检测。求所得10个D值的标准差(s),在标准曲线上对应(A0-2s)的标准品浓度即为此方法的最低检测限(注:A0为零标准品(不添加标准品)孔D值,A标为各浓度标准品孔D值)。1.4.3样品中CPFX的检测及CPFX回收率测定用ELISA试样溶液进行间接竞争ELISA检测,每个水平重复测定5次,根据间接竞争ELISA标准曲线的回归方程计算CPFX的测量值,用测量值(扣除空白)与实际值相除,即为样品的回收率。实验二“生鲜牛乳质量评价”综合实验设计内容：以市售生鲜乳样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、乳品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（相对密度、酒精实验法测酸度）、微生物检验（菌落总数、大肠菌群国标法2/平板法、美蓝还原试验）、抗生素检测（嗜热链球菌抑制法/TTC法，乳酸链球菌由实验室提供）、掺假乳实验（掺淀粉、豆浆、碱、盐、甲醛等，可做验证实验）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。一、实验目的了解生鲜乳养的采集和保存方法，掌握乳新鲜度、密度、酸度微生物含量、抗生素含量、掺假的检验方法。二、乳样的采集和保存新鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染疾病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的正常乳。采样前必须充分搅拌使混合均匀。采用直径10mm镀镍金属管或玻璃管采样，从不同深度采样。采样量若只测脂肪和酸度时50mL即可，若做全面分析取200~300mL，样品应做两个平行。快速冷却保存：0~5℃,1~2天；不做细菌学检验时可加防腐剂保存：每100mL乳加福尔马林1~2滴可保存10~15天；每100mL乳加H2O22~3滴，密闭，可保存6~10天。三、感官检验（一）检验方法1.色泽:白瓷皿中,检查是否带红色、绿色或明显的黄色；2.气味:加热后嗅其气味，不能有苦、咸、涩的滋味和饲料、青贮、霉等其他异常气味；3.滋味：品尝；4.组织状态：烧杯中静止一小时，小心倒入另一烧杯，看前一杯底是否有沉淀和絮状物，再取一滴于大拇指上，检查是否粘滑；5．杂质：是否有豆渣、牛粪、昆虫等杂质。(二)判定标准正常牛乳应为乳白色或微带黄色,具有特殊的乳香味，稍有甜味，组织状态均匀，无杂质，无凝块，无沉淀，不粘滑。四、理化分析1、相对密度（一）原理乳的密度是指在20℃时，一定体积的质量与4℃同体积水的质量之比。同温度下，乳的密度可用乳稠计测定，乳稠计有20℃/4℃（密度计）（二）材料乳稠计20℃/4℃，50℃的温度计，量筒:250ml、直径大小应使在沉入乳稠计时，乳稠计的周边和量筒内壁间的距离不小于0.5cm。（三）操作步骤1.将牛乳样品升温至40℃,上下颠倒摇荡,混合均匀后,降温至20℃(10～25℃)左右,小心地注入高度大于密度计长度,容积约250ml的玻璃量筒中,加到量筒容积的3/4时为止。注入牛乳时应防止牛乳生成泡沫，如有泡沫，用滤纸条吸去。2.放入乳稠计时，应三指捏住乳稠计上部，小心地沉入乳汁中至乳稠计示度约30刻度处，让它自由浮动，要使它不与量筒壁接触。并沿筒壁插入50℃的温度计一支。3.等乳稠计静止2～3min后,双眼对准筒内乳液表面的高度。由于牛乳表面与乳稠计接触处形成新月形，此新月形表面的顶点处乳稠计标尺的高度，即密度的数值。4..所用的乳稠计要以20℃时的数值表示。因此，如果乳样具有另一温度，则须对温度的差异加以校正。温度以20℃每高出1℃时,要在得出的乳稠计度数上加0.2°,或在密度数值上加上0.0002;而温度比20℃每低1℃时,要从得出的乳稠计度数上减0.2°,或在密度数值上减去0.0002。5.判定标准生鲜乳特级≥1.030；一级≥1.029；二级1.028；消毒乳1.028~1.0322、酒精实验法测酸度（一）材料1试剂0.5％酚酞乙醇溶液，0.1mol/LNaOH溶液，68％或70％、72％中性酒精等2器材碱式滴定管，水浴锅，250mL锥形瓶，试管，烧杯（二）操作步骤（1）吸取10ml牛乳，移入250mL锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，滴入0.5％酚酞乙醇溶液0.5mL，摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液滴定，至出现浅红色并在1min内不消失为终点。（2）将滴定时所消耗的0.1mol/LNaOH溶液的毫升数乘以10，即为牛乳的酸度（0T），也称杰尔捏尔度。（3）判断标准生鲜乳特级≤180T；一级≤190T；二级≤200T；消毒乳≤180T五、微生物检验1、菌落总数测定（一）原理菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。（二）设备和材料恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃；冰箱：2℃～5℃；恒温水浴箱：46℃±1℃；天平：感量为0.1g；均质器；振荡器；无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）；无菌锥形瓶：容量250mL、5