Bradford法测蛋白质浓度

Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三、实验过程1．准备所需的药品和仪器。2．计算所需配制的溶液的量。先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。BSA体积（ul）10080604020PBS体积（ul）900920940960980BSA浓度（mg/ml）1.00.80.60.40.23．具体操作过程。用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液。移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0mg/ml）作对照试验。用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。四、实验数据及处理测得的BSA溶液的吸光度如下：BSA浓度（mg/ml）0.100.080.060.040.020吸光度0.9710.9230.8740.8470.7460.650用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。五、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。