蛋白浓度测定

蛋白浓度测定BCA法测定样品蛋白的浓度1、原理：在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+络合，将Cu2+还原成Cu+。BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。通过制备经过梯度稀释的、浓度抑制的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质仪器检测，根据绘制出的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。2、准备：96孔板、枪（枪头）、酶标仪（提前开启）、Pierce的BCA蛋白定量分析试剂盒、PBS、蛋白标准品（-20℃分装保存）、PBS缓冲液、待测蛋白样品。注意：蛋白标准品有两种：一种是BCA试剂盒原装蛋白标准品（2mg/ml），另一种是10mg/ml蛋白标准品，需要稀释到2mg/ml。3、操作步骤：①准备1mlRIPA裂解液：加100µlphosstop、10µlcocktail和10µlPMSF到880µl1XRIPAbuffer中，混匀后置于4℃中备用。（若蛋白提取完后直接进行蛋白定量，则可直接用剩余的裂解液。）②准备BSA标准品：PierceBSA原浓度为2mg/ml，取5个200µlEP管按下表配好标准品。Standard(µg):BSAstock(µl)Water(µl)lysisBufferw/inhibitors(µl)0µg0µl3281µg2µl3082µg4µl2885µg10µl22810µg20µl128设置好每孔所加样品后（如下表）：96-wellplate123456789101112A标曲0µg标曲0µgSample4Sample4Sample12Sample12Sample20Sample20Sample28Sample28Sample36Sample36B标曲1µg标曲1µgSample5Sample5Sample13Sample13Sample21Sample21Sample29Sample29Sample37Sample37C标曲2µg标曲2µgSample6Sample6Sample14Sample14Sample22Sample22Sample30Sample30Sample38Sample38D标曲5µg标曲5µgSample7Sample7Sample15Sample15Sample23Sample23Sample31Sample31Sample39Sample39E标曲10µg标曲10µgSample8Sample8Sample16Sample16Sample24Sample24Sample32Sample32Sample40Sample40FSample1Sample1Sample9Sample9Sample17Sample17Sample25Sample25Sample33Sample33Sample41Sample41GSample2Sample2Sample10Sample10Sample18Sample18Sample26Sample26Sample34Sample34Sample42Sample42HSample3Sample3Sample11Sample11Sample19Sample19Sample27Sample27Sample35Sample35Sample43Sample43③涡旋混匀标准品，每个加10ul（横排并列第二个做复孔）。④涡旋混匀待测蛋白，每个加1ul（横排并列第二个做复孔）。⑤加140ul水到标准品孔，149ul水到待测样品孔。⑥根据数量（标品5*2个+待测样品n*2个），按A:B=50:1配制BCA工作液，每孔100ul。（若需5ml，则5mlA液+100ulB液）⑦用保鲜膜覆盖孔板后，再盖上孔板盖子，置于60℃孵育20min，在酶标仪540-570nm(562nm)处读值。4、注意事项：①在加标准蛋白或样品蛋白时，应用相应量程的枪头对溶液进行充分的混匀，以降低因溶液浓度不均对实验造成的影响。②在操作过程中，对枪的量取要细心，防止枪头内残余太多标准蛋白样品，影响标准曲线的绘制。③此法测浓度，所加的标准品及样品的量都极少，在操作过程中，在吸取标准蛋白及样品时，尽量只让枪头的口接触液面吸取，以减少实验误差。④使用排枪加液体时要注意观察排枪所吸取液体的体积是否一致，加入孔中时避免打出气泡，干扰酶标仪测定。⑤测浓度要求精确，否则会导致上样量不一致，所以每个样品都要换枪头。