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课题1微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞(1)根据你所掌握的知识，分析导致生产失败的根源是什么?(2)由此可见，研究和应用微生物的前提是什么？根源在于发酵物中混入了杂菌防止杂菌入侵，获得纯净的培养物一、培养基微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源一、培养基微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐2.特殊营养：维生素、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH、氧气的需求：4.种类：固体培养基液体培养基有无凝固剂琼脂分离鉴定工业生产化学成分：物理性质：天然培养基合成培养基一、培养基划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分天然培养基合成培养基用途鉴别培养基培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基固体培养基加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g分析营养构成？5.配制原则⑴目的明确：⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当⑶适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸（CO2碳源）生产科研耐高温需保持干燥的物品，160～170℃1～2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121℃、15～30min防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：二、无菌技术请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手2.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程二.无菌技术：防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：酒精灯旁操作超净工作台四、大肠杆菌的纯化培养分散成单个细胞,形成单个菌落3.功能：单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体1.定义：1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿倒平板约50℃防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：⑴平板划线法：菌种划3个平板1个不划线1.接种：接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）四、大肠杆菌的纯化培养平板划线时不能划破培养基，为什么？–一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；–二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液微量移液器⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍⑴平板划线法：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：1.接种：⑵稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录四、大肠杆菌的纯化培养五、课题成果评价培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃六、课题延伸（菌种的保藏）本课题知识小结微生物的实验室培养培养基无菌技术制备牛肉蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌结果分析与评价培养基的类型培养基的营养物质避免杂菌污染的方法实验室常用的消毒方法实验室常用的灭菌方法平板划线法稀释涂布法（步骤）【典例解析】例1:关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。D例2：下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是()A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。B编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入。自养型微生物含碳有机物（3）若除去成分②，加（CH2O），该培养基可用于培养。（4）表中营养成分共有类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。固氮微生物3调整pH依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）