现代生物制药技术

生物制药技术第二章基因工程制药第三章细胞工程制药第四章酶工程制药第五章动植物细胞培养技术制药第六章生物药物的提取纯化技术第一章绪论第一章绪论第一节生物制药的概念和内容生物制药是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。分类：发酵工程制药基因工程制药细胞工程制药酶工程制药第二节生物药物的性质与分类一生物药物的性质优点：毒性低、副作用小、疗效可靠。特异性特别要提到的是利用重组DNA技术生产的药品，即新生物技术药品，或简称生物新药。劣点：1成分复杂2不稳定、易变性、易失活3易为微生物污染、破坏4生产条件的变化对产品质量影响较大二生物新药的质量保证要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性。鉴定方法电泳方法、免疫学分析方法、受体结合实验、各种高效液相色谱分析法、肽图分析法、EdmanN-末端序列分析法、圆二色谱法、核磁共振法安全性评价无病毒、无菌、无热源、无致敏源致突变、致癌和致畸三生物药物的分类1氨基酸类2有机酸、醇酮类3维生素4酶及辅酶类（1）酶类药物：助消化酶类；消炎酶类；心血管疾病治疗酶；抗肿瘤酶；其他酶类：超氧化物歧化酶（SOD）PEG-腺苷脱氨酶RNA酶（2）辅酶类药物：ATPNADCoAFAD5脂类（1）磷脂类（2）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（3）胆酸类（4）固醇类（5）卟啉类6多肽和蛋白质类人体内的生物活性因子，如激素、免疫球蛋白和细胞生长因子。红细胞生成素（EPO）白细胞介素-2（IL-2）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）粒/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）肿瘤坏死因子（TNF）表皮生长因子（EGF）（用于伤口愈合）7核酸类及其衍生物（1）核酸类（2）多聚核苷酸（3）核苷、核苷酸及其衍生物8多糖升白：增加白细胞（1）抗生素（2）酶抑制剂（3）免疫调节物质（4）其他生物活性物质第三节新型生物药物研制的理论和方法新的化学实体（Newchemicalentity，简称NCE）根据NCE来源将生物药物大致分为两类：一类是利用重组DNA技术二类是利用微生物、动植物或酶生产的非上述药品，通过筛远可获得这类新药的NCE的先导物。新药研究和开发的主要过程：1确定研究计划2准备化合物3药理筛选4化学试验5临床前I期6临床前II期7I期临床8II期临床9III期临床10注册申请上市11售后监测提供6000-8000个化合物9-13年耗资约2.3亿美元先导化合物的寻找1筛选模型的确定筛选模型的核心是药物作用靶大规模筛选（High-throughputscreening，简称HTS）（1）用动物细胞和组织建立的筛选模型LC50（2）酶抑制剂的筛选（3）受体拮抗剂的筛选基因复制、转录因子为对象的治疗（1）转录因子的多样性（2）转录因子具有特异性（3）基因特异性转录因子与人类疾病有关开始考虑以凋亡为靶治疗2先导化合物来源一是从化学库或天然产物中筛选二是与受体结合的结构设计（合理新药设计）合理药物设计（Rationaldrugdesign）则是基于受体三维立体结构的认识，通过计算机辅助分子设计全程合成新分子。现今从生物中筛选新药重点放在微生物人们也开始关注植物、动物人类和动物方面，则关注自身免疫系统新药的研究与开发是一个将化学结构研究与生物活性研究连接起来的创造性过程。第四节生物药物的发展历史和概况一生物制药的发展历史李时珍《本草纲目》医生琴纳（Jenner）发明了用牛痘疫苗治疗天花1860年，巴斯德发现细菌，开创了第一次药学革命1928年英国弗莱明发明青霉素至1941年在美国开发成功。从生物体内分离纯化酶制剂的技术日趋成熟，酶类药物得到广泛应用。70年代Zenk应用植物细胞培养生产植物药物50年代提出的DNA双螺旋理论及70年代发展的重组DNA技术、单克隆抗体技术使生物制药进入一崭新的时代1982年，第一个基因工程药物人胰岛素上市另一重大认识就是认识到生物多样性对生物制药的决定性在基因工程和细胞工程技术方面的研究水平与国外水平相比差距已不大，国内已建立了40多个临床药理试验基地。二生物制药的发展概况1基因工程所依托的基础理论为Watson-Crick的DNA模板学说、Monod和Jacob的操纵子学说。（1）基因工程药物品种的开发（2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型（3）应用基因工程技术改良菌种（4）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用（5）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物（6）基因工程抗体在医药工业中的应用抗体工程2细胞工程奠定了细胞培养和细胞融合技术的理论基础（1）单克隆抗体技术生物导弹（2）通过植物细胞培养生产次生代谢产物（3）动物细胞培养三微生物工程微生物工程也称发酵工程所采用的新技术主要应用于3个方面：工艺改进、新药研制和菌种改造。微生物药物：即在微生物生命活动过程中产生的具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物及其衍生物。有酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、抗氧化剂。四酶工程酶工程是酶学与化工技术二者结合的产物第五节生物制药的发展趋势一生物制药中的新技术1大规模筛选的采用与创新大规模筛选是大规模测试化合物的方法，采用机器人自动寻找特殊生物靶，如某个细胞表面受体或一个代谢有关酶的抑制剂（拮抗剂）或激动剂（兴奋剂）的技术。2高效分离纯化系统的采用（1）固相化金属亲和层析（2）超扩散层析（3）灌注层析BioCADworkstation（4）其他快速分离纯化系统AKTAexplorer快速化工工艺开拓系统Streamline扩张柱床吸附技术快速蛋白液相色谱（FPLC）Thebiologicalsystem高分辨生物分子纯化而设计的层析系统二Humangenomeproject，简称HGP约10万个gene30亿对碱基三基因治疗基因治疗从基因角度可以理解为将外来的基因导入细胞，用正常的基因置换病源基因或补充缺失的基因，从而达到治疗的效果。基因治疗的疾病有三类：致死性遗传性疾病用过去的治疗法很难根治的癌症爱滋病等后天性疾病RNA病毒可望用RNA酶消灭图1-4为用核酸酶（RNA酶）解决的问题：提供更多可供利用的基因设计定向整合的载体：反转录病毒和腺病毒人类将逐渐具备在原子水平解决问题和在基因水平上治疗疾病的能力。四糖链工程糖科学（Glycoscience）和糖链工程即糖生物学蛋白或糖脂类对生态信息的传递起着重要的作用糖类药物五细胞因子类药物细胞因子是淋巴细胞来源的淋巴因子或巨噬细胞、单核细胞来源的单核因子、免疫系统中具有各种生物活性的一类因子的总称。对细胞因子的受体结构以及细胞因子糖链部分的结构和功能也做了大量研究。第二章基因工程制药第一节基因工程制药概述基因工程（Geneengineering），又称重组DNA技术。它能使带有支配各种各样遗传信息基因的DNA片段越过不同生物间特异的细胞壁而组入到完全不同的生物体内，定向的控制、修饰和改变生物体的遗传和变异。1人胰岛素（Insulin）具有多种生物功能，维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白质的合成。生产方式：一是分别在大肠杆菌中合成A链和B链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。另一种是用分泌型载体表达胰岛素原。2人生长激素人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。刺激身体生长hGH对一些细胞的增殖和分化以及DNA合成有直接效应。3干扰素（Interferon，IFN）同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋白，从而阻断病毒的繁殖。分为abt三型基本特性包括种属特异性、作用广谱性和选择性、相对无害性和特殊稳定性。抗细胞内侵害微生物活性；抗细胞分裂活性；调节免疫功能活性。用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病4白细胞介素白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是一类重要的免疫调节剂。激活并刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化刺激巨噬细胞和粒细胞的活性各种细胞的丝裂原治疗恶性肿瘤和病毒性疾病5集落刺激因子是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，又称造血刺激因子或造血生长因子。分类：粒细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子多能集落刺激因子功能：刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化定型、刺激终末细胞的功能活性临床多用作癌化疗的辅助药物6促红细胞生成素肾脏分泌的重要激素与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血7肿瘤坏死因子除具有抗肿瘤外，还有抗炎活性，促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质以及参与骨质重吸收淋巴细胞毒素8组织型纤溶酶原激活剂tPA是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤熔酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解。主要用于治疗血栓性疾病9心钠素较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿、气喘10重组乙肝疫苗美、法和德国都已研制出人工合成的前S多肽疫苗，具有很强的免疫原性由化学合成的HBsAg多肽与破伤风类毒素偶联形成复合蛋白分子制成的疫苗第二节基因工程制药中常用的工具酶和克隆载体一常用工具酶1限制酶它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些独特的性质种类：I型酶II型酶：简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2+，能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。限制酶的命名以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的3个字母缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。例如HindIII限制酶的特性（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构双重旋转对称排列回文结构即正读与反读都相同（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性末端或平整末端错位切断DNA---CohesiveendsFlushends识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端。同切口限制酶或同裂酶在连接酶的作用下，可以得到嵌合DNA，称为异源二聚体。来源不同的限制酶，其识别序列可以相同，但其切点位置可不同或相同。（4）某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变在非标准条件下，每种限制酶都有上述严格的识别序列导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割。称为限制酶的第2活性，又称为星活性。2DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I（1）5’-3’DNA聚合酶活力（2）5’-3’外切核酸酶活力降解RNA：DNA杂交体的RNA部分（3）3’-5’外切核酸酶活力主要功能是校对所合成的链是否能与模板精确无误地配对在一起。切口平移反应：当双链DNA的一条链产生缺口时，DNA聚合酶I将脱氧核苷酸添加到3’羟基末端上，与此同时，其5’-3’外切酶从切口的5’磷酸末端切除原有核苷酸,使切口沿着DNA平移,称为切口平移反应,又称为缺口翻译。以放射性脱氧核苷酸置换原来的脱氧核苷酸标记DNA，从而制作DNA探针。大片段即Klenow片段是用枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I而产生或者通过克隆技术而得到的单一多肽链。全酶中去除了5’-3’外切核酸酶活力，而聚合酶活力及3’-5’外切核酸酶活力均不受影响。补平限制酶切割DNA后产生的3’凹端用[32P]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序T4噬菌体DNA聚合酶与Klenow片段相似的是都具有5’-3’聚合酶活力及3’-5’外切核酸酶活力，而且3’-5‘外切酶活力对单链DNA的作用比对双链DNA更强。经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶更强的3’-5’外切核酸酶活力DNA平均长度比其他聚合酶大得多拷贝长段模板测序酶，测序酶（2.0版）完全丧失了核酸外