利用高通量测序技术发现植物小分子rna 研究进展

中国农业科学2009,42(11):3755-3764ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.11.001收稿日期：2009-01-16；接受日期：2009-03-04基金项目：国家“863”计划小麦抗病性状功能基因组项目（2006AA10A104）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2060302-10）作者简介：卫波（1981－），男，山西阳城人，博士研究生，研究方向为植物小分子RNA克隆。Tel：[phone]；E-mail:[e-mail]。通信作者毛龙（1965－），男，浙江宁波人，研究员，研究方向为功能基因组学和生物信息学。Tel:[phone]；E-mail:[e-mail]利用高通量测序技术发现植物小分子RNA研究进展卫波，张荣志，李爱丽，毛龙（中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京100081）摘要：小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型基因调控机制。它在植物的生长发育和适应外界各种环境胁迫的过程中起着非常重要的作用。植物中小分子RNA数量巨大、种类繁多，而高通量测序技术的出现大大加快了它们的发现过程。本文在简要介绍目前已知植物小分子RNA的类型及特点的基础上，综合阐述近年来利用高通量测序技术克隆和分析植物小分子RNA的研究成果，以期反映当前植物小分子RNA的基因组分布规律、功能和进化等方面的最新研究进展。关键词：高通量测序技术；454-FLX；Solexa；小分子RNA；微RNA；小干扰RNAProgressinPlantSmallRNAResearchviaHigh-ThroughputSequencingWEIBo,ZHANGRong-zhi,LIAi-li,MAOLong(InstituteofCropSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/NationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovement,Beijing100081)Abstract:SmallRNAsare20-30nucleotideslongnon-codingRNAs.SmallRNA-mediatedpost-transcriptionalregulationrepresentsanewmechanismofgeneregulationandplaysimportantrolesinplantgrowthanddevelopmentaswellasresponsestodifferentenvironmentalstresses.Inplants,therearetremendousamountofsmallRNAsofvarioustypes.Theadvanceofhigh-throughputsequencingtechnologyhassignificantlyfacilitatedtheirdiscoveries.Inthisreview,inadditiontoabriefintroductionofsmallRNAfeatures,theauthorsattemptedtosummarizerecentprogressesinsmallRNAresearchusingnextgenerationsequencingtechnologyandaimtohighlightthenewinsightsintheirgenomeorganization,functionandevolutioninplants.Keywords:high-throughputsequencing;454-FLX;Solexa;smallRNA;microRNA;siRNA0引言小分子RNA（smallRNA）是一类长20～30核苷酸（nucleotide，nt）的非编码RNA分子。自从1993年首次在秀丽线虫（Caenorhadits,elegans）中被发现后[1-2]，人们越来越多地意识到小分子RNA的重要作用[3-6]。相对于小分子RNA的巨大数量，传统的Sanger测序法操作复杂，花费大，测序深度有限，效率较低，因此在很大程度上制约了植物小分子RNA的发现速度。自2005年以来，人们开始采用以大规模平行标签测序技术（massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS）[7]、454-FLX（454lifesciences）[8]和Solexa（illumina）[9]测序技术为代表的新型焦磷酸高通量测序技术（pyrosequencing）来发掘植物小分子RNA。这些第2代测序技术尽管获得的序列较短，但具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点，因此非常适合小分子RNA测序，尤其是对那些拷贝数低的小分子RNA。以最早发现的microRNA（miRNA）为例，互补链的出现已成为衡量其是否为miRNA基因的充分必要条件[10-11]。而miRNA互补链在miRNA形成后即进入降解途径，因而拷贝数极低，利用传统测序技术一般无法检测到。因此，高通量测序技术可大大促进植物小分子RNA基因的发现过程，为研究小分子RNA的合成机制和生物学功能及其在物种间的3756中国农业科学42卷进化规律提供大量信息。鉴于小分子RNA在植物生长、发育和应答外界胁迫等方面具有重要功能[12-23]，有关其生物合成和功能研究已有多篇综述[24-27]。所以，本文在简单介绍各种植物小分子RNA特点的基础上，侧重总结近几年利用高通量测序技术挖掘植物小分子RNA的研究成果，以期反映高通量测序技术在加速植物小分子RNA发现、促进植物小分子RNA功能研究以及提高人们对植物小分子RNA进化的认识等方面的最新进展。1植物小分子RNA及其生物合成根据植物小分子RNA生物合成途径的不同，大致上可将其分为微小RNA（microRNA，miRNA）和小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）两大类型。其中siRNA又分为天然反义siRNA（natural-antisensesiRNA，nat-siRNA）、反式作用siRNA（trans-actingsiRNA，ta-siRNA）和异染色质小RNA（heterochromaticsmallRNA）[28-30]。植物小分子RNA的生物合成过程需要多种蛋白和酶的参与。在拟南芥中，III型核糖核酸酶（dicer-like，DCL）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RDRP）以及Argonaute蛋白（AGO）等都是小分子RNA生物合成路径的重要成员[31-32]。1.1miRNAmiRNA是第一类被发现并具有重要功能的内源单链小分子RNA，其长度为20～23核苷酸。每种植物中有上百个编码miRNA的基因（不同物种中的具体数目不一样）[33]，它们分别在不同的细胞和植物的不同发育阶段表达[28]。miRNA基因经转录后形成miRNA的转录本（pri-miRNA），然后在HYL1（hyponasticleaves1）、DCL1和SE（serrate）的相互作用下形成miRNA前体（miRNAprecursor或pre-miRNA）[34-36]。Pre-miRNA能够形成具有茎环特征的二级结构。miRNA则位于茎环结构的茎上。一般来讲，pre-miRNA被DCL1切割形成miRNA/miRNA*寡核苷酸二聚体。这些二聚体经甲基转移酶HEN1（HUAenhancer1）对其3′末端碱基进行甲基化修饰后成为成熟miRNA[15,37]。然后成熟的单链miRNA被组装到含有AGO蛋白的RISC（RNAinducedsilencingcomplex）中[38]。而miRNA*则被逐步降解[39]。miRNA在RISC的引导下通过切割靶基因转录本或抑制其翻译来行使基因沉默的功能[3,40]。1.2siRNAsiRNA是一类由长的双链RNA（doublestrandRNA，dsRNA）产生的小分子RNA。基因组上的许多位点都可以产生siRNA。在植物中，内源siRNA可以直接来源于转录本、转基因的反向重复序列以及转座子等。到目前为止，3类siRNA的生物合成已比较清楚[28]。第1类叫做nat-siRNA，它们产生于同一基因组位点上序列部分重叠的双向转录本，其生物合成需要RDR6及1个或2个DCL蛋白的参与。目前研究最清楚的2个nat-siRNA分别产生于生物胁迫和非生物胁迫条件下，通过下调参与产生nat-siRNA的2个基因中的1个基因的表达来实现其功能[41-42]。第2类siRNA叫做ta-siRNA，它是1类反式作用的内源siRNA。ta-siRNA调控的靶基因序列和产生ta-siRNA的序列分别位于基因组的不同位点[43]。在拟南芥中，TAS（ta-siRNA）家族的4个基因（TAS1～4）自身都是miRNA的靶基因，其转录本在特定位点被相应的miRISC剪切，切割的片段被SGS3稳定后，在RDR6的作用下合成dsRNA[44-45]，再由DCL4将dsRNA切割成21nt长的ta-siRNA[46-48]，最后ta-siRNA在AGO1或AGO7的参与下行使其功能[38,49-50]。已报道的ta-siRNA靶基因包括生长素应答因子ARF3（auxinresponsefactor3）和ARF4[46,49,51]。第3类siRNA为hcRNA，它们大多数产生于基因组中的转座子、反转录元件以及重复序列转录来的dsRNA前体，并倾向于分布在被甲基化修饰的基因组区域[25,52-53]。在生物合成时，首先在RDR2的作用下形成dsRNA，然后由DCL3将其剪切、HEN1对剪切产物进行甲基化修饰，最终形成长度为24nt的成熟siRNA，接着siRNA与AGO4或AGO6结合，形成AGO-siRNA复合体，在DRD1（defectiveinRNA-directedDNAmethylation1）和聚合酶bⅣ（polymerasebⅣ）的协作下，由甲基转移酶DRM2（domainrearrangedmethyltransferase）在相应的基因组位点上进行胞嘧啶（cytosine，C）或组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化[31,54-59]。其它类型的小分子RNA，如在哺乳动物中由于与piwi蛋白互作而得名的长度为25～31nt的piRNA（piwi-interactingRNA），在植物中尚未有报道[31,60-64]。2植物小分子RNA在基因组中的分布与染色质修饰利用高通量测序技术进行植物小分子RNA研究的最早发现是小分子RNA数量巨大和种类繁多。起11期卫波等：利用高通量测序技术发现植物小分子RNA研究进展3757初人们认为这些非miRNA的小分子RNA可能来自目标基因的随机断片。但大量siRNA的反复出现及其在基因组上广泛而规律性的分布逐渐使人们意识到它们可能是由细胞内特定的机制所产生的。现在，人们已经知道植物小分子RNA直接参与染色体修饰和基因表达调控。2005年，Meyers实验室第1次应用大规模平行测序技术（MPSS）对4个拟南芥小分子RNA文库进行了测序。对2.21×106条长度7～11nt的序列标签进行分析之后，结果令人吃惊地发现有1/2以上的拟南芥小分子RNA来自于基因组的重复序列或基因间的非编码序列，尤其是那些原来认为没有任何转录特征的区域居然也有大量的小分子RNA产生[53]。这一结果恰好解释了在以前研究中所观察到的现象，即：染色体上富含转座子的异染色质区的甲基化和乙酰化与siRNA经常同时出现[65-66]，说明植物染色体的DNA甲基化或组蛋白乙酰化修饰依