过程分子生物学(1 2012)

华东理工大学硕士研究生学位课程过程分子生物学张惠展分子生物学是生命科学的主导性学科基因的表达与调控是分子生物学的主题思想过程分子生物学是分子生物学理论发展的高级阶段1953-1983基础分子生物学阶段20世纪50年代DNA双螺旋模型的建立20世纪60年代遗传密码的破译20世纪70年代DNA重组技术的诞生1983-？过程分子生物学阶段20世纪80年代动植物转基因技术的问世20世纪90年代人类基因组计划的实施21世纪00年代RNA干扰现象的发现过程分子生物学523416基因表达的调控机制细胞通讯的分子机制免疫多样性的分子识别胚胎发育的基因表达谱肿瘤发生的分子机制基因组学与系统生物学基因表达的调控机制BCDAEF原核生物基因表达的启动开关真核生物多转录因子的协同作用原核生物的RNA结构调控真核生物的RNA剪切调控原核生物反义RNA的调控真核生物sRNA介导的RNA干扰G真核生物应答元件的转录调控1A原核生物基因表达的启动开关通过对100多个大肠杆菌启动子的序列分析，结果表明：大多数具有普通生理生化功能的基因所属的启动子，具有统一的特征序列。a大肠杆菌启动子的多样性TTGACAAACTGTTATAATATATTA16-10bp5-9bp结构基因转录起始位点-35区T82T84G78A65C54A45-10区T80A95T45A60A50T96启动子一个典型的大肠杆菌启动子通常包括下列四个结构要素：1A原核生物基因表达的启动开关绝大多数原核生物的RNA聚合酶均由五个亚基组成：a2bb’s（全酶），其中a2bb’称为（核心酶）。各种原核细菌的a、b、b’亚基呈高度的同源性，唯独s因子差别较大。RNA聚合酶核心酶对DNA链具有非特异性的亲和力（碱性蛋白与酸性DNA之间的静电引力），但s因子增强了RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合。s因子帮助RNAa大肠杆菌启动子的多样性聚合酶识别启动子，同时启动转录。大肠杆菌启动子与s因子的对应关系（Lewin‘sGENESX2010）氨基酸-35区序列识别数间隔区-10区序列因子/基因TTGACATATAAT100016-18bp613s70（rpoD）CTGGNATTGCA56bp477s54（rpoN）CCCTTGAACCCGATNT3013-15bp284s32（rpoH）TTGACATATAAT10016-18bp330sS（rpoS）CTAAAGCCGATAA4015bp239sF（rpoF）GAAYCTGA2016bp202sE（rpoE）2173sFecI（fecI）TGNCTGCGTCTT15bp1A原核生物基因表达的启动开关枯草杆菌中存在着大约二十类不同的启动子，其中有些隶属于正常的生理代谢基因，有些则隶属于噬菌体感染、孢子生成、次级代谢过程中的相关基因。b枯草杆菌启动子的多样性在SPO1噬菌体感染过程中的RNA聚合酶及其s因子SPO1噬菌体感染枯草杆菌后，早期基因表达；4-5分钟后，中期基因表达，早期基因关闭；8-12分钟后，晚期基因表达，中期基因关闭。早期基因的启动子由s43（即sA）识别启动，这是枯草杆菌细胞内具有广泛生理生化功能的s因子，与大肠杆菌中的s70同源，组成a2bb’s43型RNA聚合酶，转录中期基因表达所需的s因子编码基因gp28。中期基因的启动子由sgp28识别启动，它与枯草杆菌的核心酶构成a2bb’sgp28型RNA聚合酶全酶，负责转录晚期基因表达所需的s因子编码基因gp33和gp34。晚期基因的启动子由sgp33和sgp34识别启动，分别构成RNA聚合酶全酶a2bb’sgp33和a2bb’sgp34。SPO1噬菌体基因表达的级联调控模式通过更换不同的s因子，识别并作用于不同基因的启动子，最终导致这些基因有次序地级联表达。前一基因编码后一基因表达所需的s因子。s43s28s28s33/34早期基因中期基因晚期基因（Lewin‘sGENESX2010）枯草杆菌的孢子生成过程枯草杆菌在对数生长阶段结束后，培养基中营养物质耗尽，这时便启动孢子生成过程：先是DNA复制，隔膜形成，孢衣合成，母体裂解，孢子释放。最后在细胞内约40%的mRNA是孢子生专一性的。对数生长期细菌基因组复制隔膜形成DNA转位至前孢孢衣形成母细胞裂解，孢子释放（Lewin‘sGENESX2010）枯草杆菌孢子形成过程中的RNA聚合酶及其s因子当环境压力（例如营养成份枯竭）时，枯草杆菌细胞内发生一连串的磷酸基团传递反应，最终导致转录调控因子Spo0A的磷酸化。磷酸化了的Spo0A同时启动两种不同操纵子的转录，分别表达出sproE和sF。sF一方面启动sG的表达，另一方面又表达SpoIIR，后者再激活隔膜结合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA将母体细胞中表达的sproE裂解为有活性的sE；而在前孢区域内产生的sE均被前孢特有的蛋白酶摧毁殆尽。母体细胞中sE的活性是激活前孢区域sG所必需的（通过SpoIIA和一种未知蛋白因子）；而sG的活性又能产生一种信号，跨隔膜激活母体细胞中的sK。即：sF→sE→sG→sK。枯草杆菌孢子子交叉激活形成过程中两条途径的s因sFsEsGsK激活表达前孢区母细胞Spo0ASpo0As43s43sFsproEsEsGsproK隔膜SpoIIRSpoIIGASpoIIAsK5h5h打开262个基因打开75个基因打开48个基因打开81个基因SpoIVB枯草杆菌各类s因子识别启动子的序列偏好性Science335201219bpsAsB18bpsD15bp15bpsHsL13bpsWsF17bp17bpsGsE14bp13bpsK1A原核生物基因表达的启动开关链霉菌启动子的结构具有很大的离散性，通过对100多个启动子序列的比较，可将链霉菌启动子分成三大类：c链霉菌启动子的多样性具有典型原核生物启动子-10区和-35区特征的启动子，仅占21%具有典型原核生物启动子-10区而无保守的-35区的启动子既无典型原核生物启动子-10区又无保守的-35区的启动子1A原核生物基因表达的启动开关天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）的全基因组中存在多达65种不同的s因c链霉菌启动子的多样性s66（hrdB）链霉菌最重要的s因子，hrdB-突变是致死性的。hrdB基因全程表达，称为看家基因。sWhiG（whiG）链霉菌次级代谢基因转录所需的s因子。sF链霉菌孢子生成基因转录所需的s因子。sBldN（bldN）链霉菌气生菌丝发育基因转录所需的s因子。sR（sigR）链霉菌响应氧化压力基因转录所需的s因子。sE（sigE）链霉菌感应细胞膜完整性功能所需的s因子。子，其中已被鉴定的有：1B真核生物多转录因子的协同作用真核生物尤其是高等真核生物（哺乳动物）由于其细胞的高度分化，决定了基因转录调控机制的复杂性。与原核生物不同，哺乳动物细胞内共有三大类RNA聚合酶系统，它们均由多转录因子构成，识别三大类真核生物的启动子，分别承担rRNA、mRNA、tRNA的转录。所有三种RNA聚合酶均由8-14个亚基组成，500kD，但它们并不能单独启动基因的转录。1B真核生物多转录因子的协同作用启动子由两部分元件构成。aRNA聚合酶I启动转录的程序RNA聚合酶I定位于核仁，负责转录rRNA编码基因。RNA聚合酶I只作用于一种类型的启动子，这类高等真核生物I型启动子的结构结构基因I型启动子转录起始位点上游启动子元件（UPE）核心启动子GC丰富区GC丰富区增强启动效果启动基因转录CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG人类的这两个重复序列具有85%的同原性I型启动子介导rRNA基因转录的启动过程RNA聚合酶I在I型启动子处的定位需要两种转录因子并经历三个阶段：UBF1（UPE结合因子）装配因子SL1（四聚体核心结合因子）定位因子其中之一为TBPUBF1SL1起始位点核心启动子上游启动子元件（UPE）PolIUBF1结合在启动子的UPE处SL1结合在核心启动子处PolI加入TBP1B真核生物多转录因子的协同作用RNA聚合酶II定位于核内，负责转录mRNA的前体分子hnRNA。RNA聚合酶II及其作用的II型启动子是真核生物细胞中最广泛最典型最重要的转录启动元件。bRNA聚合酶II启动转录的程序高等真核生物II型启动子的结构结构基因II型启动子转录起始位点启动子附加区TATABOX转录的启动效率转录因子和RNApolII识别位点转录的时空特异性启动基因转录转录起始子Inr核心启动子高等真核生物II型启动子的结构结构基因II型启动子转录起始位点启动子附加区TATABOXInrOCTBOXATTTGCAT单向性Oct因子激活GCBOXGGGCGG双向性SP1因子激活CAATBOXGGCCAATCT双向性CTF/NF1因子激活上述附加区元件并不一定同时存在，而且在间隔、排列顺序、拷贝数上均有很大的可变性。高等真核生物II型启动子的结构结构基因II型启动子转录起始位点启动子附加区TATABOXInrTATABOX位于-25区，普遍存在于所有的真核生物细胞中，由八对碱基组成，两侧为GC碱基对。少数不含TATABOX特征结构的启动子成为TATA-less启动子。RNA聚合酶II与转录因子复合物装配因子TFIIABEFHJRNA聚合酶II本身由10-12个亚基组成，这些亚基具有类似于原核细菌RNA聚合酶中a、b、b’亚基的功能，但同样不能识别启动子。对启动子的专一性识别由若干的一般转录因子负责。这些一般转录因子分为两大类：装配因子和定位因子。定位因子聚合酶IITBPTAFa2bb’s因子真核生物：原核生物：II型启动子介导的基因转录启动过程各种一般转录因子和RNA聚合酶II严格按照既定的顺序依次结合在DNA及其蛋白复合物上，每种一般转录因子的加入均使DNA-蛋白质复合物的空间构象发生一次改变，而这种构象变化又是下一轮的转录因TATAStartpointTFIIDTAFsTBPTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIJTFIIHTFIIE子加入所必需的。启动子校对转录启动流产转录加固II型启动子介导的基因转录启动过程TFIIH是唯一一种具有多重独立酶活性的一般转录因子，其酶活性包括ATP酶、双向解旋酶以及使RNA聚合酶II尾部CTD结构域磷酸化的磷酸激酶。RNA聚合酶II一旦被磷酸化，所有的一般转录因子便从转录起始复合物上剥落下来，转录由起始阶TFIIJTFIIHPPPP段转换到延伸阶段。TFIIF/PolIIRNA聚合酶II在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制以RNA聚合酶II为核心的转录因子复合物在II型启动子处装配完毕后，转录启动。但随后的转录进程并非像人们想象的那么一帆风顺。事实上在很多果蝇和哺乳动物的基因中，刚刚启动转录的RNA聚合酶II会在转录起始位点下游25-50个碱基处停顿下来。一些蛋白因子促进RNA聚合酶II快速进入停顿位点，而NELF（负延伸因子）和DSIF因子则起到稳定处于停顿状态的聚合酶II的作用。快速进入停顿位点慢速逃离停顿位点RNA聚合酶II在近启动子处暂停介导的转录延伸调控机制RNA聚合酶II从停顿位点逃离的先决条件是一些能促进其逃离的蛋白因子的出现。这些因子将正转录延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶II处，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF从RNA聚合酶II上解离，后者得以逃离，新近的果蝇全基因扫描研究表明，三分之一以上的基因在转录起始后能产生短小的RNA序列，表明这种启动子邻近区的RNA聚合酶II停顿是控制转录输出的普遍战略。（Science327，2010）转录加速；反之转录将缓慢进行。1B真核生物多转录因子的协同作用RNA聚合酶III定位于核内，负责转录tRNA和小分子核内RNA（snRNA）。相应的III型启动子有两种类型：tRNA编码基因所属的启动子称为内源型启动子；snRNA编码基因所属的启动子称为外源型启动子；cRNA聚合酶III转录启动的程序高等真核生物III型启动子的结构结构基因III型内源型启动子转录起始位点