土壤微生物测定方法

土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。测定指标：1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB)能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。熏蒸提取-容量分析法操作步骤：（1）土壤前处理和熏蒸（2）提取将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L-1K2SO4（图水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L-1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。（3）测定吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018mol·L-1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L-1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。（4）结果计算有机碳量（mg·C·kg-1）WfV-VM1041203）（式中M为FeSO4溶液浓度；V0、V分别为空白和样品消耗的FeSO4溶液的体积（mL），f为稀释倍数；W为烘干土质量（g）；土壤微生物生物量碳：Bc=Ec/kEC式中Ec为熏蒸与未熏蒸土壤的差值；kEC为转换系数，取值0.382、菌种测定土壤微生物种类丰富，主要有细菌、真菌及放线菌等。各菌种在细胞代谢中起着特殊的重要作用。细菌用牛肉汁蛋白陈琼脂培养基平板混菌法培养测定；真菌用马丁氏琼脂培养基平板混菌法培养测定；放线菌用高氏1号琼脂培养基平板混菌法或淀粉按培养基稀释平板法培养测定。3、土壤呼吸强度和纤维分解强度土壤呼吸强度和纤维分解强度是土壤微生物活性的重要标志，反映了土壤中微生物活性及对有机质残体分解的速度和强度。纤维素分解强度采用埋片法；呼吸强度采用碱吸收滴定法。土壤微生物活性用土壤呼吸CO2测定法（5g鲜土于310mL试剂瓶中，22℃24h测CO2释放量(用exH23os红外CO:分析仪测定)）。直接测定土壤呼吸的方法基本可分为静态气室法、动态气室法和微气象法三种。密闭静置培养法原理：CO2+KOHK2CO3+H2OK2CO3+KOHKHCO3+KCl+H2OKHCO3+HClKCl+H2CO3操作步骤：称取20g新鲜土（为了增强呼吸作用，土壤中可加入葡萄糖，6mg·g-1）于500mL的广口瓶中，将土壤加水润湿到最大持水量的70%，用50mL小烧杯，注入20mL0.1M的KOH溶液，然后密闭广口瓶，于28℃恒温培养24h。然后取出，以酚酞为指示剂，用0.1M的HCl溶液滴定。领取同样容积的广口瓶，同上处理，不加土壤作为对照。根据两者之差，求出消耗用于吸收CO2的KOH量。4、酶活性测定土壤酶大多数来自土壤微生物，在土壤中已发现50—60种酶，它们参与并催化土壤中发生的一系列复杂的生物化学反应。如水解酶和转化酶对土壤有机质的形成和养分循环具有重要的作用。已有研究表明，土壤酶活性和土壤结构参数有很好的相关性。土壤微生物酶主要有脱氢酶、磷酸酶、精氨酸酶及芳基硫酸酯酶等。4.1脱氢酶活性的测定通过测定呼吸链脱氢酶活性可表征微生物代谢活力大小。郑志永等通过对氯化碘硝基四氮哇(INT)比色法反应条件的研究，确定了呼吸链脱氢酶活性的测定方法。4.2过氧化氢酶活性的测定（本部做，需要冰箱）土壤过氧化氢酶采用高锰酸钾容量法，以20min后1g土壤消耗KMnO4(0.11~lmol·L-1)的量表示，或运用注入土壤中的过氧化氢在反应后剩余量的方法测定。操作步骤：称取5g新鲜土壤样品于100mL三角瓶中。加入甲苯0.5mL，摇匀，与0~4℃冰箱中放置半小时。取出，立刻加入25mL冰箱贮存的含3%H2O2的水溶液。充分摇匀后，再放冰箱中半小时。取出，迅速加入2NH2SO44mL，用0.1NKMnO4溶液滴定。根据对照和试样消耗高锰酸钾的差，求出相当于分解的H2O2的量，酶活性以1g土壤、1h内消耗KMnO4的量计算。4．3尿酶活性的测定尿酶采用钠氏比色法，常用1g土，在37℃培养24h后释放出的氨态氮的含量(mg)表示；操作步骤：（1）标准曲线的绘制：分别取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mL50ug/mL的氮标准溶液于25mL容量瓶中。用水稀释至10mL，摇匀，加入1mL酒石酸钾钠，0.8mL钠氏剂，摇匀。慢慢加入4mL1MNaOH溶液，稀释至刻度，显色10min后，测定吸光度值。（2）称取5g土壤，置于100mL三角瓶中。加入10mLpH6.7磷酸缓冲溶液及0.5mL甲苯，混合处理15min后，加入10mL10%尿素溶液（对照以水代替），置于37℃恒温箱中，培养48h。（3）培养结束后，取出，加入20mL1MKCl溶液，充分摇匀10min。将悬浊液用滤纸过滤，吸取经过稀释的滤液1mL，按绘制标准曲线的操作，加入酒石酸钾钠，钠氏剂等进行显色，根据标准曲线查出氨氮含量。计算土壤尿酶的活性。4.4蛋白酶活性的测定蛋白酶活性用明胶在磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中水解生成甘氨酸的方法测定；铜盐比色法方法原理：本法以精胶为基质，酶解后所释放出的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。用比色法测定颜色深度。操作步骤：（1）标准曲线的绘制取0~20mL50ug/mL甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加之20mL，然后加入20mL新配制的铜—磷酸盐溶液，显色后于650nm处，测定吸光度。（2）测定操作称取5g土壤置于100mL三角瓶中。加入甲苯2mL，放置15min。计入20mL1%精胶溶液。于37℃恒温箱中，培养24h。与此同时，以水代替基质作为对照。培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL，显色后，测定吸光度，根据标准曲线法计算NH2-N（甘氨酸？）的含量。5、微生物功能多样性用biolog碳素分析法测定