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现代生物技术的组成：生物技术、基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、分子进化工程、酶的定向进化、生物工程下游技术生物技术：是利用生物体系，应用先进的生物学和工程学技术，加工或不加工底物原料，以提供所需的各种产品，或达到某种目的的一门新型跨学科技术基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，通过载体将目标基因导入到宿主细胞或个体，从而改变宿主遗传特性或获得基因表达产物的技术细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖，或按人们的需求设计改变细胞的某些生物学特征，从而获得某些有用的物质，或改良生物品种和创造新品的技术发酵工程：利用生物细胞的某种特性，通过现代化工程技术手段进行工业规模化生产人类所需产品的技术蛋白质工程：是以蛋白质结构，功能研究为基础，运用生物化学，分子生物学，遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成编码蛋白质的基因入手，定向的改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构性质和功能，能更好的为人类服务的一种生物技术分子进化工程：是在试管或实验室中模拟生物分子的进化，使长期的自然进化在实验中短期能实现酶的定向进化：是在试管中模拟自然进化过程的人工进化策略，利用酶基因的突变或同类酶基因片段的重组，构建某个酶的随机基因突变库，通过基因操作的方法使这些基因在微生物在表达，人工控制条件筛选出人们所需的酶生物工程下游技术：指从基因工程中获得的动，植物和微生物的有机体或器官上，从细胞工程，发酵工程和酶工程产物中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用的目的的过程酶工程:是利用酶，细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或通过对酶的分子结构修饰或改造以改善酶的特性，借助于生物反应器和工艺优化，有效的发挥酶的催化特性生产人类所需产品的技术基因工程的基本过程：①获得目的基因②将目的基因与载体连接形成重组DNA③将重组DNA导入受体细胞④筛选出能表达目的基因的受体细胞基因工程的工具酶：基因工程操作中，作为工具对基因进行切割和拼接等操作的酶，到目前为止，常用工具酶共300多种工具酶的分类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、碱性磷酸酶、逆转录酶限制性内切酶：内切核酸酶中能够识别ＤＮＡ分子上某些特定的核苷酸序列并且将其切开的酶，称为限制性内切酶有三种：Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶I型限制性内切酶：是多聚体蛋白，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在II型限制性内切酶：是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。EcoRI是最早发现的II型限制性内切酶III型限制性内切酶：识别一定的位点，但切割位点通常在识别位点一侧24bp-26bp处I型限制性内切酶和III型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可利用的DNA片段。II型限制性内切酶具有控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段。基因工程所用的限制性内切酶都是II型限制性内切酶II型限制性内切酶的识别特点和切割特性：①II型限制性内切酶识别序列的长度，一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基；②其识别位点一般都是回文结构；③产生不同的末端：黏性末端、平齐末端黏性末端：限制性内切酶错位切割DNA双链而形成的互补的单链末端（双链DNA中没有配对的碱基末端）平齐末端：有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子同裂酶：是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶同尾酶：来源不同，识别序列不同，但切割DNA分子后产生的黏性末端相同杂种位点：由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别限制性内切酶的主要用途：①在特异性位点上切割DNA，产生特意新限制性内切酶切割的DNA片段②建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱③用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA④构建基因图库DNA聚合酶：以DNA为模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。常用：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）、耐热DNA聚合酶、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、T4噬菌体DNA聚合酶、T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶Klenow片段作用：①补平限制性内切酶切割DNA所产生的3’凹端②以（32P）标记的dNTP补平3’凹端，可对DNA分子进行末端标记③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链⑤应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序耐热DNA聚合酶的作用：①DNA测序②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增DNA连接酶：能够将两段DNA拼接起来的酶叫做DNA连接酶连接酶分类：①大肠杆菌连接酶（需要NAD+，只能连接黏性末端DNA片段）②T4噬菌体DNA连接酶（需要ATP，能连接黏性末端，也能连接平齐末端）影响连接反应的因素：①温度②DNA末端特性③DNA末端的浓度和分子量碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’磷酸基，即脱磷酸作用S1核酸酶：来源：是从米曲霉中提取的活性：特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNA和单链RNA，不能降解其双链DNA和RNA的杂合子基因工程的载体：承载并携带目的基因进入受体细胞，并使目的基因得以复制或表达的DNA分子理想载体的特征：①插入外源基因前后均能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制②有适当的限制性内切酶单一酶切位点，且位于DNA复制的非必需区③具有能够直接观察的表型特征，作为重组DNA选择的标志。④易于从宿主细胞中分离，并进行纯化载体的分类：①按照介导的作用目的（克隆载体、表达载体）②按照导入的受体生物（原核生物大肠杆菌载体、酵母载体、植物载体、动物载体）③根据赋予宿主的形状（F质粒、R质粒、降解质粒）原核生物载体：细菌质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、柯斯质粒载体蓝白斑筛选重组子的原理：lacZ编码β半乳糖苷酶的α肽，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的诱导下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解为半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因此携带外源基因的重组子菌落呈白色λ噬菌体DNA：λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。两端各有12个碱基的5’凸出，黏性末端是互补的，进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。包含3个部分：①左臂（构成头部和尾部外壳蛋白基因）②中臂（非必需区，可用于改造）③右臂（λDNA复制和溶菌有关的蛋白质编码基因）柯斯质粒载体：一类由人工构建的含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。也叫黏性质粒或黏粒基因组组成：①1个质粒复制起始区域复制子②1个λ噬菌体黏性末端片段cos位点③至少1个限制酶的单一识别切割位点④至少1个抗药性选择标记基因特点：①具有质粒载体的特性②具有λ噬菌体载体的特性③具有高容量的克隆能力。可插入30-45kb的外源DNA基因工程的受体：基因工程的受体是指在转化、转导、杂交中接受外源基因，并能支持质粒、病毒进行复制扩增和表达的细胞或生物体，受体也叫宿主受体应具备的性能：①具有接受外源基因的能力，并利于表达②能表达由导入的重组体分子提供的某些表型特征，以利于转化子细胞的选择和鉴定③不适合于在人体体内或非培养条件下生存，有利于安全基因工程的研究方法：①目的基因的制备②目的基因与载体的重组③重组体DNA导入受体细胞④克隆子和筛选与表达产物的检测目的基因：是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码制备方法：①目的基因的直接分离法（限制性内切酶法、物理化学法、酶促逆转录合成法）②基因文库筛选法（鸟枪法、基因组文库法、cDNA文库法）③聚合酶链式反应法④基因的化学合成法酶促逆转录合成法：利用逆转录酶以mRNA为模板合成相应的DNA方法。主要用于合成分子量大而又不知其序列的基因基因组文库：指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体。通常是以λ噬菌体作为载体构建的cDNA文库：以某种生物成熟的mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。常以λ噬菌体和质粒作为载体构建聚合酶链式反应法（PCR）：当知道目的基因的序列或其两侧的序列时，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效的扩增出含有目的基因的DNA片段反应体系：①作为模板的目的DNA序列②与目的基因两条链的各自3’端序列互补的DNA引物③TaqDNA聚合酶④4种核苷酸4×dNTP⑤反应buffer：Mg2+基本过程：①变性（高温90-96℃下使DNA分子解链）②退火（降温25-65℃使DNA分子重新配对，引物与模板结合）③延伸（72℃下，Taq酶作用，合成DNA分子）目的基因与载体的重组：（基因重组）：利用限制性内切核酸酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，并将两者连接起来。这种连接主要靠T4DNA连接酶。包括：亚克隆、黏性末端连接、平端连接、人工接头连接、同聚物加尾连接亚克隆：把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型的载体的过程称为亚克隆。黏性末端连接：①同一限制酶切位点连接②不同限制酶切位点连接平端连接：具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接人工接头连接：是人工合成具有特定限制性内切核酸酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。将人工接头接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切核酸酶位点，应有相应的内切核酸酶切割，就可以得到互补的黏性末端重组体DNA导入受体细胞：在目的基因与载体连接成重组DNA分子后，下面的重要工作主要是将重组DNA导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子么这就是外源基因的无性繁殖，即克隆根据受体生物，将重组体导入受体细胞分为：大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法、动物细胞转化法大肠杆菌转化法：①氯化钙转化法②电穿孔法③转导氯化钙转化法（是将重组体通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程），通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞操作方法：将对数长期的大肠杆菌细胞悬浮于用冰预冷的低渗CaCl2溶液中，使细胞通透性增加；将重组DNA加入感受态细胞悬浮液，使DNA与Ca2+形成复合物，吸附于细胞表面，经42℃短暂热处理，促使外源DNA进入感受态细胞电穿孔法（利用高压脉冲使细胞膜形成小孔而导入外源DNA的技术）酵母转化法：①完整细胞转化法②原生质体转化法植物细胞转化法：①载体转化法②基因直接转化法基因直接转化法：是指不需要载体，而利用物理、化学的方法将外源基因导入受体植物细胞的技术。克隆子的筛选与表达产物的检测：将重组DNA导入受体后的下一个工作是：从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组DNA分子的菌落，或检测转化后的受体能否表达目标产物。克隆子的筛选鉴定方法：①利用抗生素抗性基因筛选②核酸分子杂交（点杂交、Southernblot—DNA、Northernblot—DN菌落杂交技术）③报告基因检测方法④利用噬菌斑的形成进行筛选⑤利用遗传互补作用进行筛选⑥重组DNA电泳基因工程在食品中的应用：1、基因工程与食品原料改良①对食品原料品质的直接改良②培育抗性动植物新品种③改良微生物的菌种特性2、基因工程与食品贮藏保鲜①PG基因工程②ACC合成酶基因工程3、基因工程与食品加工4、基因工程与食品新资源的开发5、基因工程与食用疫苗对食品原料的直接改良：①改良植物蛋白品质②通过基因工程改良脂肪酸的组成③通过基因工程增加果实的甜度④提高果实可溶性固形物的含量⑤提供维生素、微量矿物元素的含量⑥改良植物淀粉⑦提高动物源食品的生成效率及品质转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品原料、食品及食品添加剂等，简称GMF实质等同性：是如果某种转基因食品成分与和已经存在的某一食品或成分在实质上相同，那么在安全性方面，前者可以与后者等同处理。发酵工程