GB4789. 35乳酸菌检验

食品安全国家标准食品微生物学检验食品中乳酸菌检验GB4789.35－2010定义乳酸菌是指一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌通称。乳杆菌属双歧杆菌属链球菌属的嗜热链球菌本标准与GB/T4789.35-2008相比，主要变化如下：——修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。本标准的附录A为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB4789.35-1996、GB/T4789.35-2003、GB/T4789.35-2008。GB/T4789.35－2003乳酸菌饮料中乳酸菌检验流程SN/T1941.1-2007:检验方法有三部分：第1部分：分离与计数方法；第2部分：PetrifilmTM测试片法；第3部分：乳杆菌的PCR法SN标准GB/T4789.35－2008乳酸菌饮料中乳酸菌检验修订本标准与GB/T4789.35－2003相比主要修改如下：——将选择性分离培养基由改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）改为MRS培养基；——增加API50CH诊断试剂条；——乳酸菌计数由倾注法改为涂布法。2010版样品制备7.1.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。7.1.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。乳酸菌计数乳酸菌总数根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。乳酸菌计数双歧杆菌计数根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS琼脂平板，使用灭菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数。乳酸菌计数嗜热链球菌计数根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MC琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。36℃±1℃，需氧培养48h±2h后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背面为粉红色。乳酸菌计数乳杆菌计数乳酸菌总数结果减去双歧杆菌与嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。报告（GB/T4789.35-2008）根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定的乳酸菌菌落在30～300之间的平板计数，再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效数字，之后的数字，采用10的指数表示。参照GB/T4789.2规定。每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌数以CFU/g（mL）表示。报告（GB4789.35-2010）7.3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。7.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。7.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。结果的表述7.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。7.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：7.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落数的报告7.5.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。7.5.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。7.5.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。3Mpetrifilm乳酸菌的鉴定纯培养挑取3个或以上的可疑菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，兼性厌氧，置36℃±1℃恒温箱内培养48h±2h。双歧杆菌属鉴定按照GB/T4789.34。涂片镜检乳杆菌属细胞形态多样，从长的杆状和细长杆状到弯曲杆状及短杆状，一般形成链。通常不运动。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌形态为球形或球杆状，直径为0.5μm～2.0μm，细胞成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。API50CH生化鉴定试剂盒鉴定刮取纯培养平板上的单个菌落，使用API50CH生化鉴定试剂盒进行生化反应检测，表格列出了乳酸菌菌种主要生化反应。