临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究

犬细小病毒病临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究作者姓名：程雪梅指导教师：柴春彦学科（专业）：兽医论文提交日期：2008.5.20学号：1061502019关键词：犬细小病毒病，聚合酶链式反应，诊断，治疗申请学位级别：硕士犬细小病毒病临床诊断方法的筛选及新治疗手段的研究摘要对上海市犬细小病毒病进行了发病率调查，同时进行了治疗手段的调查。设计了聚合酶链式反应，免疫胶体金试纸条，酶联免疫吸附试验，血凝试验四种方法诊断犬细小病毒病。并采用单克隆抗体、干扰素、单克隆抗体干扰素相结合等综合治疗措施对该病进行了分组治疗。目的是筛选出当前最佳实验室诊断方法，并选择最适合的治疗措施。结果表明，春季犬细小病毒病在上海市的发病率高，占门诊比例的19.2%以上，应用PCR诊断诊断犬细小病毒病的准确率达95.7%，而且成本低，敏感性，特异性强，完全可以应用于实验室和临床诊断中。实验应用的综合治疗措施对犬细小病毒病早期的治愈率达84%，中期的治愈率达45%，晚期的治愈率为9%以上，是一种行之有效的治疗措施。关键词：犬细小病毒病聚合酶链式反应诊断治疗onDiagnosisandTreatmentofCanine表1犬细小病毒在不同季节的发病情况548例病犬逐月发病情况月份123456789101112发病数272432456334302897795831百分率%4.94.35.88.711.46.25.45.117.714．410．55.6图1年平均发展趋势05101520253035第一季度第三季度2001200220032004200520061．2．3传染源本病主要传染源为病犬，康复犬，以及无临床症状的带毒犬。病毒随病犬的粪便，尿液，呕吐物，唾液等排出体外，污染食物，器具等周围环境从而使犬感染。病犬在感染的第3~4天，即可通过粪便向外界排毒，此时病毒呈单个散在，传染性也最强。7~10天后随着肠黏膜IgA的产生和随出血进入肠道的IgA等CPV特异抗体的增多，散在的病毒被凝集到一起，感染性降低，血凝性也大大降低甚至丧失。1．2．4易感动物本病主要以感染未经免疫的断奶仔犬为主，成年犬发生较少，且多呈良性经过。断乳前后的仔犬最易感染，多以同窝爆发为特征，幼犬（尤其是离乳1．5~3个月的仔犬）平均发病率65．4%，有时高达100%。在养犬较集中的地方，常呈地方性流行。据统计488例病犬中，最小的为15日龄，最大的为5岁，其中，1月龄以内的7例，2~3月龄的65例，4~5月龄的254例，6~7月龄的71例，7~12月龄的44例，12月龄以上的7例。雄性犬206例，占45．98%，雌性犬242例，占54．02%；警犭431例，占96．2%，普通家犬17例，占3．8%。由此可见，本病不分品种，性别，年龄，均可发病，但以纯种警犭易感。年龄与易感性也有一定的关系，其中以幼龄犬居多。-3--1．2．5传播途径本病主要由直接接触或间接接触病犬和污染物而感染，病毒主要由感染犬的粪便，尿液，呕吐物，唾液中排出，并通过污染的食物，垫草，餐具和周围的环境而使易感犬受到感染。病毒经消化道进入机体，人工皮下，肌肉，或静脉接种也能引起发病。但特定菌丛犬症状较轻，有时仅见体温升高与血细胞减少，需要其它微生物协同作用，才会出现严重的临床症状。还本病的犬康复后，任长期带毒，可从粪尿中长期排毒，成为本病的重要隐性传染源。不经严格消毒的车辆，用具，甚至饲养和医疗人员的衣服，鞋子，器具等也可成为散播本病的媒介。1.2.6不同品种的发病情况对343例细小病毒病犬的品种进行统计，博美、可卡、京巴的发病数居前3位，占发病犬总数的60．64％。各品种的发病情况见表2表2犬细小病毒病犬各品种的发病数品种发病数/只占全部病犬比例%博美10931.78可卡5415.74京巴4513.12黑背277.87苏格兰犬247.00吉娃娃247.00西施216.12八哥102.92金毛猎犬102.92沙皮72.04其他123.05合计3431001．3发病机理病毒侵入后在感染的头两天，病毒在口咽部位复制，通过血流传播到其它器官，第3~5天出现病毒血症。虽然通常肠炎病症明显，但细小病毒病感染是全身性的。病毒是通过血流-4--而不是肠腔到达肠黏膜。基于这个原因，血清抗体效价与保护极其相关，被动获得的抗体在足够能量时完全可以保护动物。肠道IgA对保护是非必需的。知道口服CPV后4~5天，临床上才明显表现出肠道的症状。一般认为潜伏期为3至7或8天，第3天首次排毒，常在明显的临床症状出现之前排毒。犬细小病毒病的病理变化主要取决于病毒对分离细胞所需要的必要条件。因此，病毒复制主要在肠，淋巴组织和骨髓。细胞也必须具有适当的病毒受体，因为并不是所有具备细胞增值的组织都受影响。加速细胞增值有利于病毒复制，加重病理变化和临床症状。因此，如果感染犬冠状病毒先于CPV，冠状病毒通过破坏更多的成熟绒毛上皮细胞来刺激肠腺胚上皮的增值，导致双重感染，比其它任何一种感染都严重。在肠道内，细小病毒的复制杀死了肠腺的胚上皮细胞，导致上皮脱落，绒毛变短，呕吐和服泻。淋巴坏死和骨髓增值细胞的破坏导致淋巴细胞减少，严重者出现泛白细胞减少症。犬细小病毒病能很快产生棉衣，临床症状一出现即可检出细小病毒循环抗体，而在临床发病期间迅速达到高峰，能迅速产生免疫反映是疾病临床症状严重的一个关键因素。能限制病毒血症的程度和持续时间的动物，其症状就较缓和，康复的机会就较大。这可以解释为什么当灭活疫苗保护减弱时应能使犬不发病，对感染的记忆反映之快足以缩短病毒血症。如果犬在感染的急性阶段幸存下来，通常能迅速和完全地从肠炎病状康复，甚至在致命的病例，都有肠再生的例证。仅仅是现在已很罕见的心肌炎病例可导致心肌损害的慢性进行性疾病。免疫是长期的和完全的，间隔两年再受到攻击应能抵抗感染。1．4.临床症状：根据临床症状可分为两种：即肠炎型和心肌炎型。1．4．1肠炎型：肠炎型又称出血性肠炎，潜伏期7一l4d，主要表现为急性出血性腹泻、呕吐、沉郁、白细胞显著减少等症状。患犬精神沉郁，食欲废绝，呕吐，体质迅速衰弱。不久，发生腹泻，呈喷射状排出，粪便呈黄色或灰黄色，随后粪便呈番茄汁样，带有血液，发出难闻的腥臭味。体温升高到40—4l℃，呈稽留热[4]。呼吸及心跳增数(120—200次／min)。1．4．2心肌炎型：此型多见于4—6周龄的幼犬。发病的特征是临床症状未出现就突然死亡，或者是出现严重的呼吸困难之后死亡。病犬常突然病情加重，肌肉震颤，四肢末端和耳鼻发凉，可视黏膜苍白，病犬迅速衰竭，呼吸极度困难(可持续20—30min)，体温升高，心率加快(200次／min-1--1前言1．1犬细小病毒病的特性该病病原体为CPV，属细小病毒科细小病毒属，是哺乳动物中最小、结构最简单的一类单链线状DNA病毒。病毒粒子直径20nm，无囊膜，二十面体立体对称，呈圆形或六边形，其基因组大小约5KB，CPV基因组有两个主要的开放阅读框架，3’端编码结构蛋白，5’端编码非结构蛋白[1]。CPV对外界理化因素的抵抗力非常强，这与病毒的化学组成和解构特点密切相关。病毒无囊膜，不含脂质和糖类，结构坚实紧密，绝大多数病毒能耐受６５℃连续３０分钟而不丧失其感染性，个别病毒能耐受更高的温度。在ＰＨ３．０～９．０，于５６℃病毒保持感染性６０分钟，而在此条件之外，病毒感染性迅速降低。低温长期存放的CPV其感染性不发生明显变化。CPV对乙醚、氯仿、醇类和去氧胆酸盐有抵抗性，无论感染性还是血凝性都不受影响。消毒剂可用于灭活CPV,最有效的是福尔马林、氨水和氧化剂等[2]1．2流行病学1.2.1犬细小病毒病的感染CPV是1978年美国Appel[3]等从患肠炎的病犬中分离获得，主要引起犬的出血性肠炎和幼犬心肌炎，并使白细胞大量减少，幼犬的发病率和死亡率都很高。该病发现时间不长，但在欧、美等一些商业饲犬场，相继有流行和造成幼犬群损失的报道，除美国外，己相继在英国。德国和法国发现，当前己成为犬的一种重要传染病，我国亦有本病的爆发流行，并己分离获得多株病毒，研究报道日趋增多，并发现它在抗原性上与猫泛白细胞减少症病毒有密切关系[2]主要调查了上海地区５家宠物医院从2001年到2007年1500个腹泻有关病例。其中有654例犬细小病毒病.调查结果表明,春季犬细小病毒病在上海市的发病率高,占门诊比例的19.2%以上,该病死亡率达78%,且当前这些宠物医院对该病的治愈率达20%.1．2．2季节性本病一年四季均可发生，但在春季（3~6月）和秋季（9~11月）发病率较高，共统计了548例呕吐和服泻的病犬，当时疑为犬细小病毒性肠炎分别占全年发病总数的32.1%和42.6%。同时，在临床调查中还发现本病与犬瘟热有间隔爆发的流行特点。结果见表1:-5--以上)，心区听诊有明显的心内杂音，心电图显示多灶性期外收缩(即心肌损伤)。1．4.3病理剖检：死亡犬极度脱水，消瘦，腹部蜷缩，眼球下陷，黏膜苍白。肠粘膜严重剥落，肠壁弥漫性充血和出血，呈暗红色。肠淋巴结肿大、充血，肠内容物呈酱油色，具有恶臭味。幼龄死犬表现为肺淡红及轻度水肿，气管及支气管内有多量泡沫样液体，肝淤血，水肿。心肌软化，颜色变淡，心内膜及心外膜上有出血点[5]。1．5鉴别诊断1．5．1犬细小病毒病：由CPV引起，CPV能在犬肾细胞和猫肾细胞(原代和传代上皮细胞)上生长，在4℃或25℃的条件下，能聚集恒河猴的红细胞，而不聚集其他动物的红细胞，这一生物特性可对CPV作出实验室鉴定提供条件[6]。1．5．2犬瘟热：也出现呕吐、腹泻，但症状轻微，没有犬细小病毒病中的西红柿汤状暗红色的腥臭粪便。该病主要以双相热型、神经症状、后躯瘫痪、上呼吸道黏膜和眼结膜的脓性卡他、皮肤上的红色丘疹和硬足掌症为特征。1．5．3犬细菌性出血性肠炎：有食人腐败变质食物病史，尽管也发生呕吐、腹泻和脱水，但易与犬细小病毒病相区别。1．5．4犬传染性肝炎：以暂时性角膜浑浊，黄疸，囊壁水肿，肝肿大，表面呈花斑状为特征。呕吐、腹泻和脱水较轻，粪便呈黄色粥样，偶尔混有少量血液，且无犬细小病毒病粪便的腥臭味。1．5．5犬敌鼠钠盐或杀鼠迷中毒：以内、外出血为特征。外出血表现可视黏膜出血，注射针孔出血和阴道出血；内出血主要见于眼底出血，心包血肿，纵膈血肿及胸腔积血。虽然该病也出现呕吐、腹泻和血便，但症状轻微，粪便中无犬细小病毒病的特异性臭味，且有食人毒饵和毒鼠的病史。维生素Kl为本病的特效解毒药，若配合催吐洗胃等治疗措施，初、中期病犬迅速获愈。1．5．6犬钩端螺旋体病：多发于夏季(7～9月)，有明显黄疸、血尿，尿在暗视野显微镜下可检查出虫体。1.6实验室检查大细小病毒性肠炎有较明显的临床症状和病理变化，可据此做出初步诊断，但确诊必须依靠实验室诊断。常用的实验室诊断方法有病毒分离、HA/HI试验、电镜负染及ELISA和PCR-6--等。病毒分离法虽然较为敏感，但是耗费时间太长，因此一般用于新疫区，或为了对流行毒株进行研究比较[7]。1．6.1血液学检查:正常犬血液白细胞数为(6～l1)×109／L，犬细小病毒病患犬白细胞明显减少，小犬可降低到(0．1～0．2)×109／L，多数在(O．5～2)×109／L，由于其他原因引起的严重腹泻也会使白细胞减少，故此法只能作为辅助诊断。1.6．2血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HI):在诊断时，可根据病程决定选择血清学诊断方法。1）HA：取粪便样品和脏器样品处理后，用0．5％猪红细胞悬液在4℃时按比例混合，充分振荡后，结果判定的方法是以出现50％的红细胞凝集为终点，HA效价以出现终点凝集的样品最高稀释倍数表示。2）HI：将病犬血清、腹水或乳汁样品作l：5稀释，灭活后连续稀释，分别加血凝素抗原和猪红细胞。判定方法是以完全不凝集为抑制终点，样品的HI效价以其出现终点抑制的样品最高稀释倍数表示。但AnnamariaPratolli等[8]通过比较接种CPV2或CPV2b灭活苗幼犬的中和抗体反应得出以下结论：HI试验并不总能准确地评估携带有犬细小病毒病犬的真实免疫状况。进行HA试验可以取发病早期的病犬粪便，并用