RT-qPCR原理

QuantificationofmRNAusingreal-timeRT-PCRTaniaNolan1,RebeccaEHands2&StephenABustin21Sigma-Aldrich,HomefieldRoad,Haverhill,UK.2InstituteofCellandMolecularScience,BartsandtheLondon,QueenMary’sSchoolofMedicineandDentistry,UniversityofLondon,Whitechapel,LondonE11BB,UK.CorrespondenceshouldbeaddressedtoS.A.B.([e-mail]).Publishedonline9November2006;doi:10.1038/nprot.2006.236中文翻译（原理）实时RT-PCR定量测定mRNA实时RT-PCR应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定mRNA所用的的方法。尽管他被描述成“黄金”标准，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由RNA模板的多变性、含量测定的设计和方案造成的很重要的问题，与不恰当的数据标准化和数据分析一样，也是被众人所知却又忽视掉了。标准化的第一步，我们描绘了一系列RT-qPCR草案的基本的技术步骤，要求产生的数据具有可靠性和重演性。我们更愿意强调说，无论如何，RT-qPCR数据只是关于一个细胞或组织给定转录物的量的快速测定的信息。任何可变的mRNA水平的生物结果分析必须包括关于调节RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。这里描述的整个试验，包含了最初的含量设计到qPCR数据分析，需要大约15小时。INTRODUCTIONRT-qPCR包括三部分：①依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA；②用PCR扩增cDNA；③实时监测和定量测定cDNA的量尽管已经选用为定量测定RNA的方法，这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点：①结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计；②逆转录反应不是标准化的，因此，可能多变性高；③数据分析高度主观化，如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此，通过质量评估每一个RT-qPCR组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求，与人类临床诊断分析有显而易见的关系。因此，我们关注这个实验的遍及整个实验指导的质量控制。THEASSAYRT-PCR(qPCR)在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值（Ct）或交叉点（Cp）.起始浓度越高，Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管（均质）形式消除了扩增后手工操作的需要，显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。Currentproblems这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生，利用①新鲜的、冷冻的或FFPE样品；②整体活组织检查、显微切割、单个细胞、组织培养细胞；③总RNA或mRNA；④一系列不同cDNA引发机制；⑤不同的酶或酶切反应体系；⑥不同效率、灵敏度和活跃的检测⑦多样的检测试剂、反应条件、热循环仪⑧个人的分析方式及报告方法。每一步都明显不具有标准化的检测，在样品处理、对照的使用、数据处理和质量控制处理的不同使这种不标准化进一步加剧，并且与RT-qPCR的可靠性、相关性和重复性有及其密切的关系。理想的情况是，在每一步引入不确定的实验设计时，要通过比较所有可能的实验方案得出。显然这种方法的并不现实，我们提出一系列基于现在的一些想法试验方案，每一步都包含在内。逐一讨论样品的选择、储存和RNA的提取已经超出了本文的范围，我们将在别处予以介绍。本文从RNA的提取开始。我们相信这些试验方案将为大多数研究人员所接受并且能够产生可靠的数据。在每次试验中，每一个推荐的特定的试验方案的都会经过验证，但是不同的应用可能需要许多修改以适应特定的使用者。RT-qPCR操作和替换步骤的整体考虑如图2所示。RNAassessment常用的定量测定RNA的方法有很多，每年选修EMBOqPCR课程的学生一般会比较用Ribogreen、AgilentBioAnalyser、分光光度计、Nanodrop及现在使用更多的BioRadExperion用以测定相同的RNA样品。结果显示，没有任何两种方法会产生相同的数据，比较用不同方法获得的数据是不明智的。这得出这样一个结论，谨慎的做法是用同一种方法测定所有的样品并加以报道。RNAqualityRNA质量包含两方面的内容，纯度（无蛋白、无DNA污染、无抑制因子）和完整性。传统意义上RNA质量通过分析其在A260/A280时的比率，和/或分析核糖体RNA在琼脂糖凝胶上的条带以及一个最新的方法AgilentBioanalyser/BioRadExperionmicrofluidiccapillaryelectrophoresissystems。一个近期的报道声称，通过测定Agilent2100一些电泳图谱，包括测定这些区域的18Sand28SRNA片段，28S顶点高度，快速反应区比例和标志高度，并用这些计算每一个RNA样品的完整数(RIN)，可以更加客观的测定RNA的质量。然而，通过RT-qPCR分心操作得出的关于RNA样品完整性的详尽分析却得出不同的结论。作者提出，通过大量的组织样品提取的RNA样品，将他们控制分解并用AgilentBioanalyser进行分析。这些样品的RIN在10（表面上完整的材料）到4（几乎无法证明是rRNA）之间。这些样品的每一个转录物的质量都会被RT-qPCR验证。在一些组织中检测到的转录物的质量不受RNI的影响，反之，一些具有线性关系或其他具有阈值效应的会受影响。严格来说，对于不同的组织其转录物的质量和RNI值之间的关系是不同的，并且这些因子间并没有可预见的关系。作者推断适度减少RNA样品能够增加分析和定量的可靠性，只要扩增子保持较短的状态（250bp）并且不受内部影响标准化表达。这两个报道的差异可能是由于RIN和作者提倡的使用RINs的参考基因表达值之间相对较弱的相关系数（0.52）。由于缺乏一种可选择的可靠地mRNA完整性的测量标准，我们提议用GAPDH(NM_002046)从3’到5’端对目的基因进行测定。许多年来，获取的数据不依赖于rRNA的完整性，需要提供一个合理的检测目的转录物分解量化标准和规范采用微点阵使用者以及长期来被接受及常用的适用于PCR终点分析的标准方法。对无所不在表达的mRNA完整性从3’到5’端分析测量，已被GAPDH基因特异的证实，它被认为是在一个给定的样品中所有mRNA完整性的代表。然而，因为不同的mRNA降解率不同，这不可能总是作为范例，并且对于特异的目的基因设计相似的试验方案是必要的。1.3kbGAPDHmRNA的实时反应用oligo-dT作预处理，用单独的多重PCR分析测定，三重目标扩增水平的量。空间分离一个是在mRNA的5’端，第二个在中间，第三个在3’端。扩增比率反映了oligo-dT预处理的实时反应沿着整个始转录物起前进是否成功。明白地说，RT酶从5’端扩增的进行依赖于mRNA的完整性，如果mRNA降解了，酶就无法完成。显然，3’：5’的比率接近1表明其高度完整，反之，任何大于5的比率说明mRNA的分解。这个实验分析用TaqMan试剂（如：每次扩增由目标特异性差别标记探针进行检测）设计成三重分析。Inhibitorycomponents（抑制元件）抑制元件逐渐在生物体内被发现，并造成qPCR在灵敏度和动力学方面的显著降低。抑制因子可被用于生物样品中核酸的抽提或样品共纯化，例如胆盐、尿素、血红素、肝磷脂或IgG.。最乐观的情况是，抑制因子造成不精确的定量测定结果；而最糟糕的是高度抑制会产生假阴性结果。最常用的解释样品间PCR效率的不同的方法是扩增参考基因，并联报道基因，将他们的表达水平。然而，这两种方法假定两种分析是在同一抑制水平。在绝对定量测定是问题会更加显著，此测定外部校正曲线常用于计算试验样品转录物量，并常用于病原体的定量。一些或全部生物样品可能包含有抑制因子，这些抑制因子并不存在于用于建立核酸标准曲线的样品中，这导致待测样品中的mRNA被低估。应当进一步关注是，FFPE样品提取的核酸毋庸置疑的会进一步加重mRNA被低估的情况。显然，这些抑制因子更容易影响任何定量数据的比较。然而，最近的一个调查发现，只有6%的研究人员检测他们的核酸样品有无抑制因子。生物样品中抑制因子的的检测有不同的方法。在一个样品测定中PCR的效率可以通过连续稀释的样品分析检测，尽管当样品很少的时候是不现实的。例如，显微切片得到的单个细胞。此外，还有在数学上计算PCR效率，即分析扩增回应曲线的方法。共纯化和共扩大目的核酸的IAC能够检测抑制因子及显示在处理过程中模板的损失。另一个方法利用整个细菌基因组来检测临床样品中的抑制因子。最近，我们描述了一个命名为SPUD31的qPCR参考试验方案。它通过逆转录或PCR步骤检测抑制因子，即通过记录有义链扩增的拷贝数的Ct特征：一个人造扩增子(SPUD-A)被扩大成用两个引物(SPUDF和SPUDR)和用TaqMan探针(SPUDP)检测到的样品。在水溶液中，Ct值记录一个无限制反应的特征（例如，25左右）。伴随这个包含SPUD扩增子的反应，在RNA样品中进行的反应包括完全相同成分(SPUD-A,SPUD引物以及SPUD探针)。当与那些没有RNA的样品比较时，RNA样品中潜在的抑制因子导致这些反应的Ct值变高。Reversetranscription反转录RT-qPCR分析可以用单管进行逆转录和PCR或用一个或两个管分开进行逆转录和PCR。逆转录酶和cDNA引发机制的选择已经在别处被很好的考虑和讨论。由于逆转录酶的效率依赖于靶标和逆转录酶的选择，如果实验室间想要比较实验结果，用相同的酶、引发机制和试验条件是很重要的。在2004-2005年，ABRF研究的主题是cDNA的引发机制，并且每一个实验方法都有其优点和缺点。由于并没有一个最好的运行机制，在逆转录阶段，我们搜集了包含随机引物，oligo-dT和基因特异性引物的试验方案。SingleRTandPCRenzyme单独的酶，例如Tth聚合酶能够作用于RNA-和DNA-依赖的DNA聚合酶，并且用于不需要再次附加物的单管混合反应。它主要的优点是减少了手工操作的时间和污染的可能性。它也有一些缺点。第一，由于在反应开始时所有的试剂都被加到管里面，这就没有了优化两个不同反应的可能性。第二，只有用目标特异性引物才能够进行分析。第三，测量的灵敏性会降低，可能是由于Tth聚合酶的转录活性效率降低。第四，最彻底的研究即比较两种操作发现，这个反应的特征是由大量的引物二聚体聚集造成的，这可能造成定量测量的真实结果被隐藏。我们发现将变性温度降低到92.1℃，并将扩增设计的尽可能短能够减少这些问题。这可能是因为这种酶比Taq聚合酶的热稳定性稍低。SeparateRTandPCRenzymes反应可以是偶联（单管）或非耦联的的（两管）。在偶联反应中，逆转录酶在高dNTP以及目标特异性或oligo-dT引物存在的情况下合成cDNA。伴随着逆转录反应，PCRbuffer(无Mg2+)、耐热的DNA聚合酶和序列特异性引物的加入，PCR开始在同一试管里进行。在非偶联反应中，逆转录酶在第一个管中合成cDNA，在优化条件下，用随机、oligo-dT或序列特异性引物合成。逆转录反应后将组分转到另一个含有DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液和PCR引物的管中，RCR将在适合DNA聚合酶的条件下进行反应。当试验是