第二章基因工程在食品工业中的应用

第二章基因工程在食品工业中的应用第一节基因工程概述一、基因工程的定义二、基因工程的发展简史一、基因工程的定义基因是具有遗传效应的DNA分子片段，是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本单位，它存在于染色体上。基因不仅可以通过复制把遗传信息传给下一代，还可以使遗传信息得到表达，从而使后代表现出与亲代相似的性状。基因工程是在分子水平上对基因进行操作的技术体系，是将某一种生物细胞的基因提取出来或人工合成的基因，在体外进行酶切或连接到另一种生物的DNA分子中，由此获得的DNA称为重组DNA，将重组DNA导入到自身细胞或其他生物细胞中进行复制和表达等实验手段，使之产生符合人类需要的遗传新特征，或创造出新的生物类型。二、基因工程的发展简史（一）遗传物质的研究（二）基因工程的诞生和发展（一）遗传物质的研究加拿大细菌学家Avery、美国生物学家Macleod和Maclarty在纽约的洛克菲勒研究所于1944年发表的著名实验证明了DNA是细胞的遗传物质；1953年Wastson和Crick建立了DNA双螺旋结构模式；1961年Crick提出蛋白质的合成中心法则：遗传信息是从DNA到DNA的自我复制，DNA将所贮存的遗传信息转录给信使核糖核酸(mRNA)，再由mRNA翻译成蛋白质，最后由蛋白质直接或间接地表现出遗传性状；随后，Jacob和Monod发现操纵子模型，奠定了原核生物基因表达调控的理论基础。（二）基因工程的诞生和发展1965年Sanger提出了蛋白质氨基酸的序列分析法和核酸序列分析方法，使人们对DNA的结构与功能的关系有了更加深刻的认识。同时，酶学、细菌学、病毒学的发展也为基因工程的产生准备了必要的工具，1972年美国科学家Berg等首次利用限制性内切酶在体外将猿猴病毒SV40和噬菌体的DNA分别切割，并用DNA连接酶连接起来，构成了第一个重组DNA分子；1973年S.N.cohen等人在体外成功的获得质粒DNA，命名为pSC109，最后将重组质粒DNA转移到大肠杆菌细胞中并得到表达，这一研究成功标志着基因工程的诞生；1979年人胰岛素基因的重组获得成功，1997年英国科学家成功的克隆了“多莉”羊，标志着基因工程开始走向成熟。第二节基因工程工具酶一、限制性内切核酸酶二、DNA甲基化酶三、连接酶四、DNA聚合酶五、碱性磷酸酯酶六、T4多聚核苷酸激酶七、S1核酸酶八、反向转录酶一、限制性内切核酸酶（一）限制性内切酶的命名（二）限制性内切酶种类（三）限制性内切酶的基本特性（一）限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名主要是参考1973年H.O.Smith和D.Nathaus提出的原则进行的：第一个字母为细菌属名的第一个字母，第二、三个字母为细菌种名的前两个字母，构成三字母符号，该三字母符号用斜体书写，接下去是细菌株的第一个字母，用正体书写，如果同一菌株中分离出几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示，如EcoRⅠ表示从Escherichiacoli（大肠杆菌）菌株RY13中分离出的第一种限制性内切酶。（二）限制性内切酶种类1.Ⅰ类限制性内切酶2.Ⅱ类限制性内切酶3.Ⅲ类限制性内切酶1.Ⅰ类限制性内切酶该类酶由三种不同的亚基组成，辅助因子为ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸，它能识别和结合特定的DNA序列位点，随机切断识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围1,000bp范围。这类酶切割的核苷酸顺序没有专一性，无法用于分析DNA结构或克隆基因，这类酶如EcoK、KcoB等。2.Ⅱ类限制性内切酶该类酶由两个亚基构成，辅助因子为Mg2+。这类酶切割作用特异性强，能够识别专一的核苷酸序列，并在该序列内固定位置上或其附近特异切割，所以总能够得到同样核苷酸顺序的DNA片段，而且还能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子，因此，这种限制性内切酶是基因工程技术中常用的工具酶之一，如BamHⅠ、EcoRⅠ等。这类酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个，少数也有7个、9个、10个、11个核苷酸。3.Ⅲ类限制性内切酶该酶由两个不同的亚基组成，辅助因子为ATP、Mg2+，其切割位点在识别序列周围24～26bp处，因此，Ⅲ型限制酶在基因工程技术中也不常用，如EcoPⅠ、HinFⅢ等。（三）限制性内切酶的基本特性1.识别特定序列2.切割方式1.识别特定序列大多数Ⅱ型内切酶的识别序列很严格，且识别的DNA序列碱基数一般为4～8bp，富含GC，该识别序列常具有180o旋转对称性的回文结构，少数Ⅱ型内切酶能识别更长的序列，还有一些Ⅱ型内切酶能识别多种核苷酸，如HinDⅡ型的识别位点是-GTPyPuAC-，其中Py可代表C或T，而Pu可代表A或G。2.切割方式（1）在识别序列对称轴处平齐切割DNA两条链而形成的平头双链末端，称为平整末端，简称平末端。如HaeⅢ识别序列为：（2）限制性内切酶交错切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，可形成氢键，称为黏性末端，在识别序列双链DNA两条链的对称轴5ˊ侧切割产生5ˊ端突出的黏性末端，如EcoRⅠ（3）在识别序列双链DNA两条链的对称轴3ˊ侧切割产生3ˊ末端突出的黏性末端，如PstⅠ5ˊ-GGCC-3ˊ3ˊ-CCGG-5ˊ5ˊ-GGCC-3ˊ3ˊ-CCGG-5ˊ在箭头所指处切割产生5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ在箭头所指处切割产生5ˊ-CTGCAG-3ˊ3ˊ-GACGTC-5ˊ5ˊ-CTGCAG-3ˊ3ˊ-GACGTC-5ˊ在箭头所指处切割产生二、DNA甲基化酶DNA甲基化酶简称甲基化酶，是指能够识别DNA特定序列，并在其特定位置上引入甲基进行修饰的一类酶，甲基化酶与限制性内切酶具有相同的识别序列，甲基化酶使序列中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开，因此在体外重组操作中，常用甲基化酶保护基因组DNA中的相应位置不被限制性内切酶切割。三、连接酶DNA连接酶是指能将两段DNA拼接起来的酶类，这类酶能够催化双链DNA分子中相邻的3ˊ-羟基末端与5ˊ-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。在基因工程中应用最广的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶，它既可以连接带有匹配黏末端的双链DNA，又可连接两个平末端双链DNA，但这种酶只能连接双链DNA，不能连接单链DNA。T4噬菌体RNA连接酶可催化单链RNA（或DNA）分子的5ˊ-磷酸基末端与3ˊ-羟基末端形成共价键。四、DNA聚合酶（一）大肠杆菌DNA聚合酶（二）大肠杆菌Klenow片段（一）大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ是大约1,000个氨基酸的多肽链，含有一个二硫键、一个-SH以及Zn2+。该酶有三种作用：（1）5ˊ→3ˊ的聚合作用，可修补DNA或切除RNA引物后留下的空隙；（2）3ˊ→5ˊ的外切酶活性，消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸；（3）5ˊ→3ˊ的外切酶活性，切除受损伤的DNA。（二）大肠杆菌Klenow片段该酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草芽孢杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解得到的一条多肽链，具有5ˊ→3ˊ聚合酶活性和3ˊ→5ˊ外切酶活性，失去了5ˊ→3ˊ外切酶活性。它可用于填补DNA末端成为双链。五、碱性磷酸酯酶该酶来自大肠杆菌和牛小肠，能催化DNA、RNA、NTP和dNTP分子中去除5ˊ磷酸基团，其作用为：（1）去除DNA两端的5ˊ-磷酸基，防止DNA自我环化；（2）同位素32P标记的5ˊ-OH末端制备DNA或RNA探针时，先用该酶去除5ˊ-磷酸基，产生5ˊ-OH末端，再进行标记。六、T4多聚核苷酸激酶该酶来源T4噬菌体感染的大肠杆菌，能够催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5ˊ-OH末端，主要作用是为DNA的5ˊ末端进行标记；对准备连接但缺乏5ˊ磷酸的DNA或化学合成片段的5ˊ-OH加上磷酸基团。七、S1核酸酶该酶于1965年从米曲霉中分离纯化得到的，能够特异降解单链DNA或RNA，产生带5ˊ-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。八、反向转录酶反向转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶，使用该酶可以获得目的基因，也可用来标记cDNA作为放射性分子探针。第三节基因工程载体及其选择一、大肠杆菌载体二、酵母载体三、植物载体四、动物载体一、大肠杆菌载体（一）质粒载体（二）噬菌体（三）柯斯质粒载体（一）质粒载体质粒载体是一种存在于细菌或细胞染色体外的能够独立复制的遗传物质，一般为环状双链共价闭合环形DNA分子，长度为2～200kb。基因工程使用的质粒是经过人工改造过的，通常需要去除原质粒的非必要功能区，引入选择标记和适宜的限制酶单一酶切点。常见的质粒载体为pBR332和pUC质粒。pBR332由4363bp组成，有一个复制起点（ori），一个抗氨苄青霉素基因（Ampr）和一个抗四环素基因（Tetr），多种限制性内切酶位点，可容纳5kb左右的外源DNA，见图2-1。pUC质粒是由大肠杆菌pBR质粒与M13噬菌体改造而成的双链环状DNA克隆载体。如pUC19，长2686bp，带有改造后的复制起点，拷贝数高，可达500～700个。该质粒携带一个抗氨苄青霉素基因，一个LacZ（大肠杆菌乳糖操纵子β-半乳糖苷酶基因）的调节片段LacZˊ（编码β-半乳糖苷酶基因的α-肽链）和一个调节LacZˊ基因表达的阻遏蛋白的基因LacⅠ，见图2-1。（二）噬菌体基因工程常用的噬菌体有λ噬菌体、M13噬菌体等。λ噬菌体有头和尾两部分组成，是线性双链DNA分子，其宿主为大肠杆菌。目前，广泛使用的λ噬菌体是经过人工改造的，根据插入方式可以将λ噬菌体分为两大类：第一类是插入型载体，即非必要基因区有一种或几种限制性酶切点，能够使外源基因插入，而不损失其本身的任何基因片段的载体；第二类是置换（取代）型载体，即非必要基因区有两个或两个以上的限制性酶切点间DNA片段可被外源基因取代。通常λ噬菌体可携带5～20kb的外源DNA，重组λDNA可以与λ噬菌体的头部蛋白和尾部蛋白在适当的条件下构成具有感染力的完整噬菌体颗粒。M13、fd、fI这三种丝状噬菌体均为环状单链DNA基因组，M13噬菌体DNA是由6,407个核苷酸组成，进入宿主细胞后，在宿主细胞内复制出互补的DNA链，形成双链环状DNA，此时的DNA可以同质粒DNA一样进行提取和体外操作，而且无论是双链的还是单链的M13DNA均能感染宿主细胞。（三）柯斯质粒载体柯斯质粒载体也称装配质粒，是人工构建的质粒载体，分子量较小，一般为4～6kb，含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，具有质粒载体和λ噬菌体载体的双重特性，而且具有高容量的克隆能力，柯斯质粒载体的克隆极限可达到45kb左右。二、酵母载体（一）整合型载体（YIP）（二）复制型载体（YRP）（三）附加体型载体（YEP）（一）整合型载体（YIP）YIP由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成，其中酵母DNA片段只提供筛选标记，因此，YIP质粒载体在酵母细胞中不能够自主复制，载体DNA与受体酵母染色体DNA同源重组被整合到染色体DNA上，随染色体DNA一起复制。该载体对酵母转化率低，拷贝数低，但转化子稳定。（二）复制型载体（YRP）YRP由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成，其中酵母DNA片段既提供筛选标记，又携带酵母DNA的自主复制顺序（ARS），而且大肠杆菌质粒也具有自主复制基因，因此该载体能在大肠杆菌和酵母菌这两种细胞内复制，这种载体属于穿梭载体。YRP载体对酵母细胞的转化率高，拷贝数也高，但转化子不稳定。（三）附加体型载体（YEP）YEP由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2μm质粒为环状双链DNA结构，长度为6,813bp，含酵母体内自主复制点（ori）和在受体内能使质粒部维持稳定的序列（STB）。YEP载体转化率极高，拷贝数也极高，是常用的载体。三、植物载体植物载体包括农杆菌质粒载体、植物病毒和植物转座子等。目前在这些植物载体中，农杆菌质粒载体是最广泛应用的，如Ti质粒。Ti质粒是植物根癌农杆菌菌株中的质粒，能够诱发植物形成冠瘿瘤。该质