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第2章植物快速繁殖技术2.1试管苗快速繁殖意义和一般程序2.1.1试管苗快速繁殖意义试管苗快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。试管苗快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛、产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化。2.1.2试管苗快速繁殖的一般程序一般选择根、茎、叶器官为培养材料进行培养、壮苗与生根培养、试管苗驯化与移栽几个环节。①研究根系生理代谢的优良实验体系②研究营养吸收、生长和代谢的变化规律③建立快速生长的根无性系④进行诱变育种2.2器官培养2.2.1根的培养2.2.1.1根无性繁殖性的建立根无性繁殖系1.2cm接后1周侧根反复转接无菌种子2.2.1.2培养多为无机离子浓度低的怀特培养基。也可用2／3MS或1／2MS、B5培养基注：离体根生长要求提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养温度25－27℃，暗光培养。概念：切取茎的先端或茎尖分生组织进行无菌培养。意义：微茎尖培养可获得脱毒苗；茎尖培养技术简单，操作方便，易成活，成苗时间短，加快繁殖。2.2.2茎尖培养类型：根据培养目的和取材大小分为：微茎尖培养;普通茎尖培养茎尖培养的类型普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽。微茎尖为0.3-0.5mm取材材料处理及消毒培养茎尖培养的方法接种①直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（1－2cm）（取前可喷杀菌药，可顶芽或侧芽）。②从试管苗获取。2.2.2.1取材取1-2㎝顶梢①顶梢切割成0.5-1.0cm的茎尖（除叶,剥去休眠芽的鳞片）②茎尖流水冲洗2-4h③75%酒精迅速漂洗30s④0.1%升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒5-8min(取自老枝条上的可适当延长时间）2.2.2.2材料处理及消毒接前可再剥去一些叶片。然后随切随接，动作迅速。亦可将切下茎尖材料在1-5%VC液中浸一下。2.2.2.3接种培养基①基本培养基：MS、White、B5、Heller。②蔗糖作碳源效果好，浓度2－3%。③激素和有机添加物有明显影响。但激素浓度以0.1mg/L为宜，不要太高。2.2.2.4培养培养条件①光强：1000－3000lx；光照时间：16h。②温度：25℃左右③昼夜温差有或无，以植物或培养过程来定④干燥季节注意保湿。2.2.3茎段的培养2.2.3.1材料选择与处理嫩枝去叶，剪3-4cm长水冲洗1-3h,75%酒精30-60s，0.1%升汞3-8min(饱和漂白粉液10-20min，无菌水冲洗数次。2.2.3.2接种与培养培养基：MS腋芽增殖效果：BAKT、ZT，生长素改善苗生长，GA促芽伸长。注意激素配比。继代增殖途径：促腋芽快速生长；诱导形成不定芽。1.成苗途径与意义2.材料选择与消毒3.接种4.培养2.2.3叶的培养幼嫩叶片流水冲洗70-75%酒精漂洗10s饱和漂白粉液浸3-15min（或在0.1%升汞液5-8min）无菌水冲洗多次后，用无菌滤纸吸干水分2.2.3.1材料选择与灭菌上表皮朝上接种培养基。最好带叶脉，注意极性2.2.3.2接种外植体大小：5×5mm薄片培养基：MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4－D利于愈伤组织形成，NAA抑制芽形成，利于根发生，KT、6BA利于芽形成。培养条件：25－28℃，10－14h光照，1500-3000lx（不定芽分化和生长再强些）。2.2.3.3培养2.2.4.4植株再生途径直接产生不定芽形成愈伤组织形成胚状体其他途径2.3壮苗和生根培养2.3.1试管苗的壮苗培养较高浓度的生长素与较低浓度的细胞分裂素组合有利于形成壮苗.在生产实际中，增殖系数控制在3.0-5.0时可实现增殖和壮苗的双重目的。另外，改善培养室环境条件，如增加光照强度、降低湿度等对培养壮苗也有一定帮助。2.3.2试管苗的生根培养生根培养基：1／2或1／4MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。培养条件：增加光强，达3000-10000lx。2.3.2.1生根方法与途径将新梢基部浸入50ppm或100ppmIBA溶液中处理4-8h；在含有生长素的培养基中培养4-6d直接移入含有生长素的生根培养基中。容易生根的植物，延长在增殖培养基中的培养时间即可生根；适当降低增殖倍率，减少细胞分裂素的用量，即可增殖又可生根；对易生根植物，切割粗壮的嫩枝用生长素溶液浸醮处理后在营养钵中直接生根，此方法省去了生根阶段，但只适于一些容易生根的植物。2.3.2.2影响试管苗生根的因素植物材料基本培养基植物生长调节剂培养条件其它物质2.4试管苗的驯化与移载试管苗生态环境与自然环境的差异试管苗的特点试管苗的驯化试管苗的移栽2.4.1试管苗的特点2.4.1.1试管苗的生态环境（1）高温且恒温（2）高湿（3）弱光（4）无菌2.4.1.2试管苗的特点（1）生长细弱，角质层不发达（2）光合作用差（3）叶片气孔数少，活性差（4）根吸收功能弱2.4.2试管苗的驯化目的：提高试管苗的适应性，促其健壮，最终提高移栽成活率原则：从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑。驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。方法：即炼苗。不开口自然光下2-3天，然后开口1-2天。2.4.3移栽基质的选配河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1-2mm。草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。2.4.4试管苗的移栽移栽方法：取出试管苗，全部轻洗去培养基栽入基质(事先浇透水)后，栽后轻浇薄水，移入高湿环境(90%以上)。移栽场所：日光温室塑料大棚驯化室2.5移栽后管理2.5.1保持小苗水分供需平衡1周内：环境高湿，遮光。1周后：揭膜，控水，增加光强.半个月后：小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端通风。2.5.2防止菌类滋生基质高压灭菌或3h烘烤灭菌或太阳能灭菌。◆适当使用杀菌剂、消毒剂。◆移栽时少伤苗。◆喷水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生长。2.5.3温度、光照条件的控制适宜生根温度：18－20℃。移栽初期弱光，后逐渐加强光照，过渡到自然光照。2.5.4保持基质适当的通气性基质配比：珍：蛭：草(腐殖土)=1：1：0.5，珍：草(腐殖土)=1：1保持基质通气性：选颗粒状基质，浇水勿多。2.6组培中三大难题污染的原因及预防褐变的原因及预防玻璃化的原因及预防2.6.1污染污染是指在组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量菌斑，导致培养材料不能正常生长和发育的现象。2.6.1.1污染的类型与症状引起污染的微生物主要有芽孢杆菌、大肠杆菌等细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌。细菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现黏液状或浑浊的水迹状菌落，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚。真菌性污染的症状：培养基或培养材料表面出现不同颜色的菌落，继而很快形成黑、白、黄、绿等孢子，与培养基界限不清。2.6.1.2造成污染的因素培养基及各种使用器具灭菌不彻底；外植体灭菌不彻底，有菌残存在细胞组织中；操作时人为因素带入；环境不清洁；超净工作区域不清洁。2.6.1.3控制污染的措施（1）培养基和接种器具彻底灭菌（2）防止外植体带菌（3）严格遵守无菌操作规程（4）保持环境清洁（5）超净工作台2.6.2褐变褐变是指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐而死亡的现象。2.6.2.1褐变的原因褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。2.6.2.2影响褐变的因素（1）植物材料：植物基因型、材料年龄、取材部位、外植体大小及受伤程度。（2）培养基成分：无机盐浓度过高、CTK水平过高。（3）培养条件：光照过强，温度过高，加速褐变。（4）材料转移时间2.6.2.3褐变的预防措施（1）选择适宜的外植体（2）选择合适的培养条件（3）连续培养（4）加抗氧化剂（5）加0.1－0.5%活性炭2.6.3玻璃化玻璃化：离体培养物的嫩茎或叶呈半透明水渍状。为生理失调症。2.6.3.1玻璃化发生的原因（1）激素浓度（尤其CTK）增加或CTK╱IAA高（2）琼脂浓度低（3）光照时间大于15h（4）温度低（5）通风条件不好（6）培养基离子种类及比例不适宜2.6.3.2预防玻璃化的措施（1）适当控制培养基中无机盐成分。（2）适当提高蔗糖和琼脂浓度。（3）适当降低CTK和GA的浓度。（4）增加自然光照，控制光照时间；（5）适宜的培养温度。（6）改善培养器皿的气体交换状况。（6）培养基中添加其它物质。2.7植物无糖培养植物无糖培养快繁技术又称为光自养微繁殖技术，是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输入CO2气体作为碳源，并控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。2.7.1无糖组培技术与常规组培技术的区别CO2代替了糖类作为植物体的碳源环境控制促进植株的光合速率使用多功能大型培养容器多孔的无机材料作为培养基质封闭型培养室2.7.2无糖培养微繁殖技术的优势极大地促进了植株的生长和发育污染率大幅度减少提高试管苗移植的成活率消除了小植株生理和形态方面的紊乱工程方面的优越2.7.3无糖培养与有糖培养相结合实践证明，无糖培养与有糖培养相结合，可以进行二者之间的优势互补，既能降低成本，又可在短期内培养育出大量合格的组培苗木，是当前组培工作中一项可行的技术措施。2.7.4植物无糖组培快繁技术的限制因素需要相对复杂的微环境控制的知识和技巧实际应用还是受到一定的限制，原因就是需要应用微环境控制方面专业的技术培养的植物材料受到限制与一般的微繁殖相比，光自养微繁殖需要较高质量的芽和茎，外植体需具有一定的叶面积，带绿色子叶的体细胞胚也可进行光自养生长2.7.5无糖组培技术国内外研究进展2.7.6植物无糖组培快繁技术应用前景2.7.7无糖培养技术应用实例2.7.7.1香石竹2.7.7.2草莓2.7.7.3情人草2.7.7.4桉树2.7.7.5非洲菊2.7.7.6大花蕙兰本章小结思考题1.试管苗有哪些特点？如何炼苗？2.怎样提高试管苗移栽的成活率？3.移栽后的幼苗在管理上该注意哪些问题？4.组培过程中污染产生的原因有哪些？如何防止污染的产生？5.什么是褐变？褐变产生的原因有哪些？如何控制褐变的产生？6.什么是玻璃化？玻璃化产生的原因有哪些？如何控制玻璃化？