香蕉的组织培养与快速繁殖

香蕉的组织培养与快速繁殖摘要香蕉，芭蕉科芭蕉属植物，又指其果实。热带地区广泛栽培食用。香蕉味香、富于营养，终年可收获，在温带地区也很受重视。香蕉也是一种绿色开花植物，它如其他绿色开花植物一样，也会开花结籽儿。野生香蕉中有一粒粒很硬的种子，吃起来极为不便。因此，有人把野生香蕉树和四倍体的芭蕉杂交产生了三倍体的香蕉。也就是现在的香蕉。这样的香蕉中就没有种子了。香蕉的种子退化了，人们常通过香蕉地下的根蘖幼芽来繁殖它的后代，现在随植物细胞工程的发展，植物组织培养及快速繁殖更加高效进行香蕉繁殖，同时为其优良品种的保存扩大提供有利条件。关键词：香蕉；植物组织培养；快速繁殖；转化1.香蕉植物组织培养长期以来,香蕉生产上主要采用吸芽繁殖,用这种常规方法繁殖,不但故量有限,而且挖取吸芽还会伤及母株的地下真茎及挖断母株的根群,从而影响当年产量。同时,挖取的种苗切口大,成活率低。为了提供发展香蕉生产所需的大量种苗,应用植物组织培养技术,繁殖大量香蕉苗是非常必要的。此外,通过组织培养还可加快优良品种的繁殖速度,以满足生产上品种更新的需要。1.1香蕉组培苗的培育技术1.1.1品种的选择选用适宜当地栽培、高产、优质、抗逆性强的品种，选取剑状吸芽若干个进行脱毒。1.1.2原种吸芽苗的选择选作吸芽的母株果梳应是果梳整齐、果大均匀、产量高、无病害症状、健壮的母株。用作外植体的剑叶吸芽必须按株系进行编号并建立株系档案，必要时拍照全株相片。1.1.3香蕉吸芽外植体的消毒与接种从田间取回来的吸芽用自来水冲洗干净后，用不锈钢刀将吸芽切去根和顶端，剥去外层包片并切成高2厘米×直径1.5厘米左右的圆锥体。在超净工作台上，用75%酒精消毒2分钟，倒掉酒精，再用0.1%升汞，另加2～3滴吐温80，消毒20～30分钟。消毒剂一定要浸过料，消毒过程中要经常摇动以便材料充分灭菌。用无菌水清洗4次，使药液彻底洗净。用解剖刀剥去外层叶鞘，留用5毫米左右的基座，并将此圆锥型外植体十字形切为4块，编号后，置入诱导培养基中培养，培养温度为27℃～31℃。开始培养时，可只用自然弱光，待长小芽后光照采用800～1000Lxs。1.1.4.继代苗的培养将已开始增殖的芽顶部叶片切除，切除的叶片可作为病毒检测的材料。将基部切成含有2～4个芽的小块，转接到继代培养基中培养。培养温度27℃～31℃，光照为800～1000Lxs，经检测不带生产上检定病毒的株系方可作为繁殖材料继代增殖。20～30天继代一次，继代培养次数不超过12代。1.1.5生根苗的培育将假茎生长至2厘米左右的无根继代苗转入生根培养基中培养，培养温度为27℃～31℃，光照2500～3000Lxs，每天光照的时间为10小时左右。1.1.6组培苗的炼苗培养将培养室内培养的约3厘米高以上的组培苗转换至外界自然光温条件下培养，待叶片转浓绿色后（时间大约7～10天）开始移栽。移栽时最好先打开塑料袋一个晚上，第二天用清水冲洗掉根部的培养基，并根据苗的大小进行分级。1.1.7检疫性有害生物的检测和变异株的剔出1.1.7.1病毒的种类主要检测束顶病（BBTV）和花叶心腐病（CMV）。1.1.7.2检测方法采用血清学DAS-ELISA法检测。1.1.7.3变异株的剔出按香蕉组培检定苗质量标准中规定的6种变异株予以剔出。变异株的6种类型：①假茎和叶片、叶脉变红；②假茎变青、叶片尖形，叶柄细长；③假茎矮粗，叶距较密集、叶片短圆（矮变）；④叶片卷曲对称；⑤叶片出现黄、白色条纹或缺绿斑块；⑥植株生长特快，和一般的植株不一样，叶片特大，杆特粗（高变）。1.2不同植物生长调节剂对香蕉组织培养的影响以MS+3%蔗糖+0.6%琼脂作基本培养基,每个处理3次重复,每个重复10株(块),接种后置于室内日光灯下培养,光照强度为1500~2000lx,每天光照12h,培养温度为(28±2)℃。诱导培养于第二代接种后30天、分化培养于接种后20天、生根培养于接种后30天进行调查观察,计算各处理的芽诱导率、增殖率(倍)和生根率。诱导培养试验设NAA添加浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/L和6-BA添加浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mg/L共25个处理。各供试品种取嫩球茎,在自来水冲浴下除去外层叶片,置于0.1%HgCl2溶液中浸泡15min,无菌水冲洗5次,然后在超净工作台上沿球茎生长点纵切成2~4块,每块大小约3cm3,分别接种到诱导培养基中进行培养,每代培养30天。分化培养试验设NAA添加浓度为0.0、0.1、0.2、0.3、0.4mg/L和6-BA添加浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L共25个处理,将经2代培养并诱导成功的芽体分别转接到分化培养基进行分化培养,每代培养25天。生根培养试验设NAA添加浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L和6-BA添加浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08mg/L共25个处理,将分化的丛芽切成单株,分别转接到生根培养基中进行培养。由上可得出普通香蕉(巴西蕉,AAA)诱导成苗为6-BA5.0mg/L+NAA0.02mg/L,继代增殖培养为6-BA4.0mg/L+NAA0.1mg/L,生根培养为6-BA0.02mg/L+NAA0.8mg/L;粉蕉(ABB)诱导成苗为6-BA10.0mg/L+NAA0.04mg/L,继代增殖培养为6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L,生根培养为6-BA0.02mg/L+NAA0.8mg/L;贡蕉(AA)诱导成苗为6-BA7.5mg/L+NAA0.02mg/L,继代增殖培养为6-BA4.0mg/L+NAA0.1mg/L,生根培养为6-BA0.02mg/L+NAA0.8mg/L。植物生长调节剂的生理作用具有两面性,它既能促进生长、增殖,也能抑制生长,甚至杀死植物,其关键取决于植物生长调节剂的种类、浓度及植物细胞的年龄和器官的种类等,一般低浓度下促进生长,中等浓度下抑制生长,高浓度下致畸致死植物。在普通香蕉、粉蕉、贡蕉组织培养生产中,如果植物生长调节剂的种类、浓度组合使用得当,完全能够获得满意的效果。2.农杆菌介导的香蕉遗传转化对于大多数的香蕉产区,香蕉生产长期遭受着诸如香蕉束顶病、香蕉花叶心腐病、香蕉枯萎病、香蕉叶斑病和香蕉交脉蚜等病虫害的严重威胁，这些病虫害不仅使植株长势受到影响,甚至给香蕉生产带来毁灭性的灾难。由于香蕉的种质资源相对缺乏,现有的香蕉品种中还未发现高抗病品种。香蕉栽培品种绝大多数都是三倍体,难以采用传统的育种方法进行遗传改良，因此,利用转基因技术对香蕉进行遗传改良就显得尤为重要。香蕉是作为生物反应器生产口服疫苗的理想材料,要将香蕉变成现实的生物反应器,实现香蕉的产业升级,必须建立有效的转基因技术平台。2.1农杆菌介导的香蕉遗传转化研究2.2影响农杆菌介导香蕉转化的几个重要环节2.2.1侵染过程用基因枪(轰击用的金微粒不包被外源DNA)轰击植物组织造成微伤,植物组织受伤后释放出的信号诱导分子,可以促进农杆菌对转化材料的吸附。用抽气减压或离心力的作用使农杆菌与植物细胞充分接触,也可大大提高农杆菌对香蕉外植体材料的附着。2.2.2受体材料目前香蕉转基因研究中所采用的外植体材料主要有：胚性悬浮细胞或原生质体，茎尖分生组织和茎微盘。其中胚性悬浮细胞使用最为广泛,该体系的优点是细胞分裂旺盛，单细胞起源的体细胞胚胎发生可避免嵌合体的产生，与其他外植体材料相比，胚性悬浮细胞更有利于T-DNA的摄入和整合。2.2.3Vir区的活化在香蕉组织本身可以产生少量信号物质的基础上，外源乙酰丁香酮(AcetosyringoneAS)的加入可以克服香蕉细胞分泌酚类信号物的不足,从而大大激活vir(virulence)区基因的表达，促进外源基因向宿主细胞核中转移。2.2.4菌液浓度及侵染时间对转化效率的影响菌液浓度和侵染时间是影响转化效率的重要因素,所以最佳的菌液浓度及侵染时间是高效转化系统所必须的。2.2.5预培养与共培养对转化效率的影响预培养有利于提高外源基因的瞬时表达和转化效率。侵染后的共培养时间也是影响转化频率的一个重要因素。共培养时间太短,不利于外源基因整合到受体细胞基因组中并诱导受体细胞的分化,共培养时间过长,外植体周围的农杆菌生长过旺,以致于掩埋整个外植体,使部分外植体因褐变而死亡。2.2.6不同农杆菌菌株类型的影响EHA105是常用的超毒力菌株,比其他菌株更常用于香蕉的转化。2.2.7启动子转基因植物能否成功的应用很大程度上取决于启动子驱动外源基因的表达水平。在香蕉转基因研究中常用到的启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，玉米泛素蛋白启动子(Ubi)，水稻肌动蛋白启动子(Act)。参考文献杨秀坚,孙诚志.2005.不同植物生长调节剂对香蕉组织培养的影响.广东农业科学.第六期：35-38王丽萍,邓泽周,吴勇谋等.2014.皇帝蕉组织培养与快速繁殖技术研究.中国南方果树.43(2):71-73赵静,金志强,徐碧玉.2006.根癌农杆菌介导的香蕉遗传转化研究进展.遗传.28(12):1619-1626吴坤林.2006.香蕉的生物学特性及其组织培养技术.生物学通报.41(10):5-7林贵美.2005.香蕉组培苗的研究与推广.中国热带农业.24-27夏晶晖,鲜敏,杨春艳.2002.香蕉的组织培养与快速繁殖.西南园艺.30(3):3-4李华平,胡晋生,王敏等.2000.香蕉茎尖遗传转化法研究.热带作物学报.21(4):33-38黄永红,易干军,周碧容等.2006.香蕉遗传转化方法研究进展.分子植物育种.4(3):79-84郑晓英,欧阳曙.1989.植物组织培养在香蕉生产上的应用.亚热带植物通讯.36-38马雪筠,周丽侬,陈俊秋.1989.香蕉组织培养快速繁殖技术的研究.广东农业科学.22-24