第三章：病毒的增殖

第三章病毒的增殖§1细胞—病毒的增殖场所一、胞膜吸附、侵入、释放、生物合成二、胞浆生物合成、装配、形成包涵体三、胞核生物合成、囊膜的获得、形成包涵体§2病毒的增殖过程动物病毒的增殖过程大致分为5个主要阶段:吸附侵入脱壳病毒成分的合成装配与释放一、吸附病毒与细胞表面特异性受体发生碰撞，病毒附着于细胞受体而引起的病毒感染的第一阶段。病毒吸附分两步进行：•可逆吸附：病毒与细胞以静电引力相结合，是一种非特异性的吸附。•与细胞和病毒的浓度成正比；也与溶液中的Ca2+、Mg2+、和Na+等离子有关（促进或抑制作用）；单纯的稀释或冲洗以及应用抗病毒血清或高浓度的盐类和一定的pH环境都可使病毒重新解脱。解脱的病毒具备感染性。•不可逆吸附：病毒蛋白（吸附蛋白）与细胞膜表面特定蛋白（细胞受体）的特异性结合。并非所有的病毒都有这2个阶段。o通过外力作用使病毒解吸，病毒不再具备感染性。o细胞表面的特定受体决定了细胞对病毒的易感性o不同病毒完成吸附所需时间不一样，但大多数病毒可以在1h之内完成吸附过程二、侵入病毒不可逆地吸附于细胞受体后，病毒以核酸或核衣壳或病毒颗粒等形式进入细胞的过程。（一）噬菌体1．无囊膜噬菌体利用尾部的溶菌酶部分破坏细菌细胞壁，尾管刺入细胞，将病毒核酸注入细胞，衣壳留在细胞外2．有囊膜的噬菌体机理仍不清楚（二）植物病毒其侵入细胞的方式主要有三种：1．由携带有病毒的介体（主要是具有吸口器的昆虫）在植物上取食，或以其它方式将病毒带入细胞；2．通过自然或人为的原因造成的植物细胞壁上的伤口进入细胞：大多数实验室采用的感染方式。3．通过植物细胞与外界环境沟通的胞外连丝和沟通两个相邻细胞的原生质体的胞间连丝进入细胞（三）动物病毒1、细胞吞饮病毒：e.g多瘤病毒2、病毒直接转入胞浆（跨膜移位）：e.g.小RNA病毒3、病毒囊膜同细胞膜融合：由病毒的具有细胞融合活性的包膜糖蛋白介导e.g.副粘病毒的F糖蛋白，单纯疱疹病毒的gB糖蛋白，流感病毒。三、脱壳脱壳是病毒侵入细胞后，病毒的包膜或壳体去除而病毒核酸释放出来的过程，包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。噬菌体的脱壳与侵入一起发生；植物病毒脱壳方式了解较少；动物病毒由于不同的结构类型和不同的侵入方式，脱壳过程较为复杂：1、呼肠孤病毒，并不发生完全的脱壳，以内吞方式进入细胞后，吞噬泡与溶酶体结合形成次级溶酶体，病毒外壳中近50%的壳体被溶酶体中的蛋白酶水解，余下的壳体与病毒核心形成亚病毒颗粒，病毒的基因组的转录均在亚病毒颗粒内进行。2、有些在细胞核内增殖的DNA病毒，如乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒，其核衣壳在未被完全脱壳的情况下就进入细胞核3、口蹄疫病毒可能就在细胞膜上脱掉衣壳，病毒核酸直接进入细胞内。4、痘病毒：较为特殊外层囊膜在胞膜或吞饮泡膜上被融合,病毒核心进入胞浆内，核心借助自身衣壳上的依赖DNA的RNA聚合酶合成mRNA，进一步译制出一些早期蛋白质，这些蛋白质中有脱壳酶，该酶反过来帮助病毒核心进一步脱壳。四、病毒大分子的合成隐蔽期（晦暗期）：从侵入细胞的病毒粒子消失开始，到新的病毒粒子出现为止的一段时间。痘病毒10h，脊髓灰质炎病毒2~4h病毒核酸的复制和蛋白质的合成可以分成几个连续阶段：1.mRNA的早期转录2.mRNA的早期翻译——早期蛋白质包括：1）酶：在病毒的核酸复制、晚期转录和晚期翻译中发挥作用2）其它蛋白质（功能蛋白质）：参与改变或抑制宿主细胞大分子合成（影响细胞正常生物合成）。3．病毒核酸的复制病毒核酸及其转录和复制分为6个基本类型第一类病毒的核酸复制1）双链DNA病毒：呈半保留型复制（PRV）第二类病毒的核酸复制+2）单链DNA病毒（PPV）第三类病毒的核酸复制3）双链RNA病毒（IBDV）保留型复制：指母代双链在复制子链过程中，一方面产生子链，一方面母链又重新结合，结果在产生的两个子代中，一个仍是母代原来的双链。第四类病毒的核酸复制4）单股正链RNA病毒（FMDV）第五类病毒的核酸复制5）单股负链RNA病毒（NDV）第六类病毒的核酸复制6）反转录病毒（HIV）4．mRNA的再度转录（晚期转录）在新合成的RNA聚合酶的作用下，由母代病毒和子代病毒的DNA进一步转录出第二批mRNA。某些RNA病毒则仍由RNA直接转录5．mRNA的再度译制（晚期翻译）晚期蛋白，包括病毒衣壳蛋白以及病毒编码的其它蛋白。五、装配和释放1．装配：新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染细胞内组装成完整的病毒颗粒的过程。无囊膜病毒壳体与核酸结合形成的核衣壳即为成熟的病毒；囊膜病毒需要在核衣壳外加上包膜。病毒的装配效率很低，往往只有不到50%的子代病毒成份能组装成完整的病毒粒子。装配的机制：a.自我组装（大多数病毒）：b.指导装配：需要病毒基因组编码的非结构蛋白（形态发生因子）的脚手架作用或蛋白质水解的切割作用。2．释放新形成的子代病毒粒子由细胞内到细胞外的过程。1）细胞自身的溶解将病毒释放出来2）不发生明显细胞病变的病毒的释放方式，目前还不十分清楚。3）小RNA病毒合成速度极快，病毒粒子在胞浆内大量积聚，在细胞死亡之前，就可胀破细胞、释放病毒。4）有囊膜病毒的释放过程也就是病毒衣壳获得囊膜的过程。5）疱疹病毒很少释出于细胞外，而是通过细胞间桥或融合细胞而传播。小结：不同病毒生物合成和装配的场所不同1．大多数DNA病毒：疱疹病毒、腺病毒、乳多空病毒在胞核内合成DNA，装配过程亦在胞核中进行。2．DNA病毒中的痘病毒和虹彩病毒在胞浆内合成病毒DNA，其装配也在胞浆内完成。3．RNA病毒均在胞浆内增殖。§3病毒的非增殖性感染和缺损病毒一．定义非增殖性感染：指病毒在感染细胞内合成了某些甚至全部的病毒成分，但不能装配成完整的具有感染性的子代病毒粒子的现象，称为非增殖性感染（non-productiveinfection)或流产感染(abortiveinfection)缺损病毒：在感染细胞内不能形成成熟病毒粒子的病毒。缺损病毒往往由于病毒基因组中一个或一个以上在病毒复制过程中较为重要的基因丧失了功能，导致病毒复制不能进行。二．缺损病毒分类1．依赖辅助病毒的缺损病毒1）干扰缺损（defectiveinterfering,DI）病毒：在病毒感染时产生的一类亚基因组缺失突变体。它们因失去了其亲代病毒基因组中的复制必需片段，所以不能单独进行复制，而必需在其同型的完全病毒（标准病毒）的辅助下，由完全病毒提供DI颗粒已丧失的、但又为复制所必需的基因功能才能复制。标准病毒（standardvirus,SV）：与DI颗粒相关的完全病毒。2）卫星病毒：存在于自然界中的一种绝对的缺损病毒，基因组与辅助病毒的DNA或RNA没有任何的同源性。e.g.细小病毒科中的腺联病毒只能在有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞内复制。2．伪装性缺损病毒：指具有病毒衣壳及完整外表，但衣壳内的病毒核酸被细胞源性的核酸完全所取代的缺损病毒。主要见于多瘤病毒和噬菌体。3．条件性缺损病毒：在一定条件下能增殖，但在其它条件下发生流产感染。如：温度敏感突变株，宿主易感突变株三、组织细胞培养（一）细胞原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长增殖。继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。优点：1)可以无限的传代。2)很多细胞系对病毒很敏感。3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。(二)细胞分散剂胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）与钙、镁离子结合灰色链丝菌酶（三）细胞的保存１．细胞培养物的常温短期保存1）实验室中细胞短期保存将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存，可达15天以上。将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天传代一次。2）长途运送细胞培养物的保存取刚刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右，到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。２.细胞培养物的长期保存将刚长满单层的细胞，按细胞传代方法消化吹散后，装入离心管中，3000r/min5-10min，用适量的含有20%犊牛血清、10%二甲亚砜（DMSO）的DMEM悬浮，分装于细胞冻存管中，置4℃2h，-20℃2h，-70℃过夜，然后置于液氮中长期保存。或在液氮气相中过夜，然后置于液氮中长期保存。或置于液氮气相中，按5min1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。（四）细胞的复苏将冻存于液氮中的细胞取出，迅速置于42℃~50℃水浴中，并不停地摇动，使其快速解冻，然后离心去掉冻存液，用生长液悬浮，再置于细胞培养瓶中进行培养，或者不离心直接转移到细胞培养瓶中，等其贴壁几小时后，再换入新的生长液继续培养。细胞冻存与复苏的基本原则：缓慢降温，快速解冻思考题1.病毒的增殖周期包括哪几个阶段？2.为什么在接种病毒时要吸附一段时间？不吸附可以吗？3.对于一个特定的病毒而言，往往有一定的宿主细胞范围，这是为什么？4.什么叫吸附？病毒的吸附分为哪几个阶段？处于这两个阶段的病毒有什么区别？5.缺损病毒主要有哪几种？它们之间的区别何在？6.各种病毒的增殖场所有什么不同？7.动物病毒侵入细胞的方式有哪几种？8.细胞膜、细胞浆和细胞核在病毒的增殖过程中各有什么意义？9.细胞的长期冻存与复苏要遵循什么样的原则？具体如何操作？