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保存和稳定性：试剂盒要保存在室温下（15-25度）。建议将纯化柱保存在4度，可储存多于一年。任何在保存过程中产生的沉淀都可以在37度恒温中溶解，然后在使用之前冷却至室温。注意：每次用后用纯化柱后都要关紧袋子。GeneJETGelExtractionKit50preps#K0691250preps#K0692BindingBuffer30mL150mLWashBuffer(concentrated)9mL45mLElutionBuffer(10mMTris-HCl,pH8.5)15mL30mLGeneJETPurificationColumns(preassembledwithcollectiontubes)50250说明书TheGeneJET™GelExtractionKit，设计的目的是从在TAE或者TBE缓冲液里电泳的标准或者低熔点的琼脂糖凝胶中，高效快速回收纯化DNA片段。这个试剂盒以便利的旋转层析柱的基础上，应用了基于二氧化硅薄膜的专利技术。试剂盒可以用于纯化20-25bp大小的DNA片段。在100bp–10kbDNA片段大小范围内，回收率提高到95%。每个GeneJET纯化柱可纯化高达25μgDNA，可用高达1克的琼脂糖凝胶。整个过程只用15分钟，分离的DNA片段将用于普遍的下游应用，包括连接反应，限制性设计，PCR，测序和分子标记。原理：目的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳后分割，将其置于微型离心管中，用BindingBuffer溶解后上柱，BindingBuffer中的促溶剂可以溶解琼脂糖，变性蛋白质，促进DNA结合到层析柱的硅膜上。另一点方便的是，BindingBuffer中含有颜色指示剂，可以检测DNA结合最好时的溶液PH，杂质经过简单的清洗步骤就可以去除。纯化的DNA用ElutionBuffer从层析柱中洗脱出来，回收的DNA可用于下游应用。重要的注意事项:1、在最开始使用试剂盒前，用96-100%的乙醇稀释WashBuffer。50preps#K0691250preps#K0692WashBuffer(concentrated)9mL45mLEthanol45mL225mLTotalVolume54mL270mL2、加入乙醇后，在盒子的复选框中标记，以注明完成的步骤。3、每次用之前，检验BindingBuffer是否生成沉淀。假如有沉淀，将溶液置于37度使其溶解，然后冷却至25度。4、用BindingBuffer时要带手套，因为里面含有刺激性物质。5、当提取的DNA直接用于测序时，不能使用重复利用的电泳缓冲液。额外的材料和需要的设备：96-100%乙醇异丙醇3M醋酸钠，PH5.2（可能不用）微型离心机1.5或2毫升微型离心管加热器或水浴锅开始前多注意事项：1、开始操作前阅读注意事项。2、所有纯化步骤在室温下操作。3、所有的离心条件都要保证在桌面微型离心机中的转速大于12000g。操作步骤：步骤1：用解剖刀或剃刀片切割含有DNA片段的凝胶，尽可能的靠近DNA片段切割，以减小凝胶的含量，将胶片放在事先称重的1.5毫升离心管并称重。记录胶片的重量。注意如果纯化的DNA片段用于克隆反应，要避免暴露在紫外灯下对DNA的损害。减少紫外线照射时间到几秒钟，或在紫外照射期间保持胶片在玻璃或塑料盘中。步骤2：加1:1量的BindingBuffer到胶片中（量以重量计，如每100毫克琼脂糖凝胶加100微升的BindingBuffer）注意：对于琼脂糖含量大于2%的凝胶，要用2：1的比例加BindingBuffer到凝胶片中。步骤3：在50-60度的条件下温育凝胶混合物10min，或者等到凝胶全部融化。每隔几分钟将试管颠倒混匀一次，促进胶融化，保证胶全部溶解。在上柱前将凝胶混合物快速涡旋混匀一次。检查溶液的颜色，黄色是结合DNA的最佳PH。如果颜色是橙色或紫色，要加10μLpH5.2的3M醋酸钠溶液，混匀，溶液会变为黄色。步骤4：（500bp-10kb的片段才有此步）如果该DNA片段为≤500bp，以1:2的体积比例将100％异丙醇加至已溶解的凝胶溶液（如100μL异丙醇应该被添加到溶解100毫克凝胶片的100μLBindingBuffer中）。彻底混匀。如果该DNA片段是10kb的，以1:2的体积比例将水加入到已溶解的凝胶溶液（如100μL水应该被添加到溶解100毫克凝胶片的100μLBindingBuffer中）。彻底混匀。步骤5：转移最多800μL凝胶溶解液到基因回收纯化柱。离心1分钟。弃去流出液，然后将柱放回相同的收集管。注意：如果总量超过800μL，溶液可以分几次加入。每次操作后离心30-60s并丢弃流出液，重复操作，直到所有溶解液都加到离心柱膜上，但是每个柱不能超过1克琼脂糖。每次使用后盖紧装有纯化柱的袋子！步骤6：可选步骤。当纯化的DNA将被用作测序时，才有此次结合步骤。加100μLBindingBuffer到GeneJET纯化柱。离心1分钟。弃流出液，然后将柱放回相同收集管。步骤7：加入700μLWashBuffer（已用乙醇稀释）到GeneJET纯化柱。离心1分钟。弃去流出液，然后将柱放回相同的收集管。步骤8：离心空GeneJET纯化柱1分钟，彻底去除残留的WashBuffer。注意：这一步是必要的，以避免在纯化的DNA溶液中残留乙醇。残留乙醇的存在可能抑制下游酶促反应。步骤9：将GeneJET纯化柱转移到一个干净的1.5ml离心管，加50μLElutionBuffer于纯化柱膜。离心1分钟。注意：（1）对于DNA含量低的，洗脱体积可减小以增加DNA浓度。（2）20-50μL之间的洗脱液体积不显著减少DNA产量。但是洗脱体积应不小于10μL。（3）如果DNA片段10kb，使用到柱上前先将ElutionBuffer预热至65°C。（4）如果洗脱体积为10μL并且DNA含量≤5微克，离心前室温下孵化离心柱1分钟。步骤10：丢掉GeneJET纯化柱并储存纯化的DNA在-20℃。问题分析：1、DNA产量低的原因和解决方法：（1）凝胶片不完全溶解。确认以1:1的体积将BindingBuffer添加到称好的凝胶片（例如每100毫克琼脂糖凝胶，加100μL的BindingBuffer）。确保凝胶切片加到GeneJET纯化柱之前完全溶解。大量琼脂糖或凝胶切片用琼脂糖百分比大2%，可能需要额外的时间以使其溶解。在某些情况下，较大体积的BindingBuffer和凝胶溶液的额外的涡流混匀，可以促进溶解。（2）低效的DNA结合。凝胶片完全溶解后检查溶液的颜色。黄色颜色表示DNA结合的最佳pH值。如果溶液的颜色是橙色或紫色，加10μLpH5.2的3M醋酸钠溶液，混匀。混合的颜色会变黄色。（3）低效的膜清洗。确保首次使用前，浓缩的WashBuffer已经用乙醇稀释。（4）低效的DNA洗脱。直接将ElutionBuffer添加到膜的中心，而不是到GeneJET纯化柱的侧面。用20-50μLElutionBuffer，确保该体积完全覆盖膜表面。在纯化含量较大的DNA片段时（15μg），可将ElutionBuffer的体积增加至两倍或执行两次洗脱循环。在步骤8中，确保所有残留的WashBuffer从膜中除去，长时间离心有助于去除WashBuffer。2、DNA在琼脂糖凝胶中保存不好的原因及解决方法：存在残留乙醇。在步骤8中，确保所有残留的WashBuffer从膜中除去，长时间离心有助于去除WashBuffer。3、低质量的测序结果的原因及分析：重复利用电泳缓冲液引起的污染。如果提取的DNA将被直接用于测序，应该用新配制的电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶和进行电泳。4、下游应用不成功的原因及分析：（1）残留的乙醇的存在。在步骤8中，确保所有残留的WashBuffer从膜中除去，长时间离心有助于去除WashBuffer。（2）低效的膜清洗。如果收集管在洗涤步骤过程中装的过多，部分WashBuffer可能残存在GeneJET纯化柱的底部。每次离心后将流出液丢弃，以避免此种情况。（3）琼脂糖洗脱液污染。确保凝胶切片按照步骤1-4正常溶解。确认以1:1的体积将BindingBuffer添加到精确称好的凝胶切片中。大量琼脂糖与琼脂糖凝胶的百分比大于2％，可能需要更多的时间来溶解。通常情况下，加入大量的BindingBuffer或将凝胶溶液频繁的涡旋混匀数次，可以促进溶解。（4）洗脱液沾染过多的盐。确保在步骤7中的清洗是高效的。在离心之前，用WashBuffer孵育GeneJET纯化柱几分钟。安全信息：BindingBuffer中可识别的危险成分：硫氰酸胍。Xn有害。危险警语：R20/21/22吸入，皮肤接触及吞食有害。R32与酸接触释放剧毒气体。R52/53对水中生物有害，可能对水生环境产生长远的不良影响。安全警语：S9保持容器在通风良好的地方。S23不要吸入气体/烟雾/蒸汽/喷雾。S36/37穿戴适当的防护服和手套。S60本物质及其容器必须作为危险废物处置的。S61避免释放到环境中。参考特别的指示/安全数据表。