天然药物有效成分提取分离技术(研)

天然药物有效成分提取分离技术中草药以植物药为主，而植物都是由复杂的化学成分所组成。其中主要有纤维素、叶绿素、单糖、低聚糖和淀粉、蛋白质和酶、油脂和蜡、树脂、树胶、鞣质及无机盐等。其中，许多物质对植物机体生命活动来说不可缺少，称为一次代谢产物。一般认为它们在药用上是无效成分或杂质。而另外一些化学成分如：生物碱、黄酮、蒽醌、香豆素、木脂素、有机酸、氨基酸、萜类、苷类等对维持植物生命活动来说不起重要作用，称为二次代谢产物，这些物质在植物体内虽含量很少，多则百之几，少则百万分之几，甚至更少。但它们往往具有较强的生理活性，其中有些已应用于临床，我们称之为有效成分。当然有效成分与无效成分的划分是相对的，如天花粉的引产有效成分是蛋白质，香茹中的多糖对实验动物肿瘤有显著的抑制作用。在进行中草药成分提取前，应注意对所用材料的原植物品种的鉴定并留样备查。同时要系统查阅文献，以充分了解，利用前人的经验。中草药有效成分的提取分离一般有下面两种情况：第一、从植物中提取已知的有效成分或已知的化学结构类型者。如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素；三棵针中提取黄连素等(提取有效成分)。或从植物中提取某类成分如总生物碱、总酸性成分。如从银杏叶中提取总黄酮；从大黄中提取总蒽醌(提取有效部位)。工作程序比较简单。一般先查阅有关资料，特别是工业生产的方法，搜集比较该种或该类成分的各种提取方法，再根据具体条件加以选用。(注意先重复该方法，得到产品后，再结合生产实际，不断改进工艺，达到大生产要求)。第二、从中草药中寻找未知有效成分或有效部位时，情况比较复杂。只能根据预先确定的目标，在临床或药理试验配合下，经不同溶剂提取，以确定有效部位。然后再逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效成分。一、中草药有效成分的提取对中草药化学成分的提取，通常是利用适当的溶剂或适当的方法将植物中的化学成分从植物中抽提出来。常用的方法有溶剂法、水蒸汽蒸馏法和升华法等。其中后两种方法的应用范围十分有限。现分别介绍如下：（一）溶剂提取法1、溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出的成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。根据“相似者相溶”的经验规律，中药化学成分可通过结构去估计它们的性质，亲脂性的中药成分易溶于亲脂性溶剂，难溶于亲水性溶剂。反之，亲水性成分则易溶于亲水性溶剂。据此，可选择适当溶剂从中药中提取所需成分。常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序表示如下：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇1、水提取法水是一种强杉性溶剂。中草药中亲水性成分如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐和苷类等都能被水溶出。游离生物碱可与酸生成盐而溶于水，因而可用酸水提取。有机酸、黄酮、蒽醌、内酯香豆素和酚类成分可与碱成盐而溶于水，可用碱水提取。提取方法可分为水煎、水浸和水渗鹿三种。例：①从三棵针中提取小檗碱；②从槐米中提取芦丁；③从甘草中提取甘草酸等。2、醇类溶剂提取法大多数中草药成分都可用醇（EtOH,MeOH）或含水、含酸的醇来提取。以乙醇最为常用，由于醇类溶剂兼有亲水性的醇羟基和亲脂性的烷基，因此，具有溶解度范围大，适用范围广的特点。除了强亲水性蛋白质、多糖、无机盐；强亲脂性叶绿素、油酯、脂溶性色素、蜡等成分外，其他成分都可用醇来提取。在实验室和工业生产中，该方法使用最为普遍。提取方法：冷提、回流提取3、亲脂性有机溶剂提取一般适用于挥发油、油酯、叶绿素、植物甾醇、萜类、游离生物碱及苷元等弱极性成分的提取。例：①从穿地龙中提取薯蓣皂苷元（用溶剂汽油）；②萝芙木根中提取利血平（苯为溶剂）。提取方法：回流提取；连续提取。4、二氧化碳超临界萃取。5、利用膨缩原理提取6、超声提取（二）水蒸汽蒸馏法该法只适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏，与水一发生反应，而且难学或不溶于水的成分的提取。中草药中的挥发油及某些挥发性成分能用水蒸汽蒸馏法得到。但应用范围有限。例：麻黄碱、菸碱、槟榔碱、牡丹酚、大蒜素的提取。（三）升华法固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可利用升华法直接自中草药中提取出来。如：樟木可樟脑；茶叶中咖啡碱；大黄中游离羟基蒽醌的提取。二、中草药有效成分的分离和精制1、结晶和重结晶结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同达到分离的方法。一般来说，从不是结晶状物质处理得到结晶状物质，这一步叫结晶。从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶，称重结晶。采用结晶法首先要注意结晶的条件（如选择合适的溶剂、合适的温度和时间、有效成分在欲结晶的混合物中的含量等）。其中最主要的是选择合适的溶剂。该溶剂对欲纯化的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热都易溶。其次是有效成分在待结晶的混合物中的含量，一般说含量愈高愈容易结晶，有的化合物要比较单纯时才能得到结晶。因此，必须注意中药的粗提物先用其它方法尽量除去杂质后，再采用此法。2、沉淀法①溶剂沉淀法：在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离的方法。常见的有a.在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇（水提醇沉法），以沉淀除去糖类、蛋白质、果胶、无机盐等水溶性杂质；从中草药中提取多糖类成分也可采用此法。b.醇提水沉法：在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、果胶、粘液质、叶绿素等水不溶性杂质。C.醇/醚法或醇/丙酮法：该法主要用于沉淀皂苷类成分，而将脂溶性的树脂等类杂质留在母液中，一般将粗皂苷溶于少量醇中，然后逐滴加入乙醚或丙酮，摇均，皂苷即析出。②酸碱沉淀法：对酸性、碱性或两性有机化合物来说，可通过加入酸、碱以调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。a.酸提取碱沉淀法：主要用于生物碱的分离精制，含生物碱的药材用酸性水提出后，加碱调至碱性生物碱即可沉淀析出。b.碱提取酸沉淀法：主要适用于黄酮、蒽醌及其它酚酸性成分的分离和精制。③金属盐沉淀法：常用铅盐（中性和碱性醋酸铅）、钡盐、钙盐、铜盐等。例中性皂苷和酸性皂苷的分离可用铅盐法，向混合皂苷的水溶液或醇溶液中先加入中性醋酸铅则酸性皂苷形成铅盐沉淀，而中性皂苷则留于溶液中，据此，可将两者分开。另外，在粗制皂苷的水溶液中加入碳酸铜溶液，搅拌，可使鞣质、色素等杂质沉出除去。④试剂沉淀法：分离生物碱尤其是水溶性生物碱常加入苦味酸、苦酮酸、雷氏铵盐等生物碱沉淀试剂，生成的生物碱盐通过复分解反应或加入无机盐处理又得到原来的生物碱。胆甾醇试剂常用于沉淀甾体皂苷，从而与三萜皂苷分开。3、pH梯度萃取法：将被分离物质溶解在与水不相溶的有机溶剂中，用碱水使pH由低到高或用酸性水使pH由高到低，依次萃取，达到分离目的的方法。常用于不同碱度的生物碱分离和不同酸度的蒽醌苷元和黄酮苷元的分离。4、盐析法：在中药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低而析出沉淀，从而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐的氯化钠、硫钠、硫酸镁、硫酸铵等。例三七的水提液中加入硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出；自黄藤中提取掌叶防己碱；自三棵针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠盐析制备；将羊角拗和酒精提取物溶于水，水液用铅盐法除去杂质后，加入硫酸铵饱和，即析出粗强心苷。5、透析法：利用小分子及小离子在溶液中可通过半透膜，而分子及大离子不能通过的性质，借以达到分离。例如分离纯化皂苷，蛋白质、多肽、多糖等成分时，可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。6、两相溶剂萃取法⑴液-液萃取与分配系数K值两相溶剂萃取法定义：利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配民系数的不同而达到分离的方法叫两相溶剂萃取法。溶质在两相溶剂中的分配系数K在一定温度及压力下为一常数：K=CU/CLK：分配系数CU：示溶质在上相溶剂中的浓度CL：示溶质在下相溶剂中的浓度。假定：A、B两种溶质用氯仿/水进行分配，A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3/VH2O=1则在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，溶质A90%以上分配到上相溶剂中，10%以下分配到下相溶剂中。计算方法：KA=10/1A=10/11100%=90.91%。同理：溶质B的分配与A相反，10%以下在上相中，90%以上在下相中。计算方法：KB=0.1=1/10B=1/11100%=9.09%。⑵分离难易与分离因子β分离因子β可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。β=KA/KB(注：KAKB)，上例中，β=KA/KB=10/0.1=100β≥100仅作一次简单萃取就可实现基本分离100β≥10则须萃取10-12次β≤2须作100次以上萃取β≌1则KA≌KB意味着两者性质极其相近，或甚至即为同一物质，故即使作任意次分配也无法实现分离。⑶分配比(系数)与PH对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统PH的影响。原因是PH变化可以改变它们的存在状态(游离型或解离型)，从而影响在溶剂系统中的分配比。对酸性物质(HA)，其在水中的解离平衡及解离常数K可用下式表示：两边取负对数注：Ka越大，酸性越强；PKa值越小，酸性越强。若使该酸性物质完全解离，即使HA均转变成A-，则故若使该酸性物质完全游离，即使A-均变成HA则酚类化合物PKa值一般为9.2-10.8；羧酸类化合物PKa值约为5。因而PH3以下，大部分酸性物质将以非解离形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中，而PH12以上时，则将以解离形式(A-)存在，易分配于水中。同理，对碱性物质(B)，其碱性强弱可用其共轭酸(BH+)的解离常数Ka-或PKa-值表示。Ka-越小，碱性越强；PKa-越大，碱性越强。一般PH3时，酸性物质多呈非解离状态(HA)，碱性物质则呈解离状态(BH+)，但PH12，则酸性物质呈解离状态(A-)，碱性物质则呈非Ka=[A-][H3+O][HA]HA+H2OA-+H3+OPKa=PH-log[A-][HA]PH=PKa+log[A-][HA]≌PKa+log1001()PH≌PKa+2PH≌PKa-2BH++H2OB+H2+O（共轭酸）（共轭碱）Ka-=[B][H3+O][BH+]PKa-=PH-log[B][BH+]解离状态(B)存在。据此，可利用PH值的不同将酸、碱物质分开。三、层析法Chromatography层析技术目前已广泛应用于各种化合物的分离分析，发展很快，它已成为化学实验室不可缺少的分析分离手段。层析法是一种使不同分子相互分离的过程，当一混样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体（移动相）通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使用权各组分通过固定相支持体的速成率不同而得到期分离。按其操作方法，在柱上进行称为柱层析；在薄层上进行称为薄层层析；在纸上进行称为纸层析。层析法按分离原理可分为⑴吸附层析（利用吸附剂对样品吸附能力的差别进行分离）；⑵分配层析（利用样品组分在二种不相互溶的溶剂中分配系数的不同进行分离）；⑶离子交换层析（利用样品组分在离子交换树脂上交换能力大小不同进行分离）；⑷凝胶层析（利用分子筛分离物质的一种方法）。(一)薄层层析：薄层层析是50年代初发展起来的一种新型、快速、简单、高效的层析法。薄层层析的操作方法是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的，因为岐析是在薄层上进行，所以称它为薄层层析。薄层层析在天然药物化学中应用：⑴天然药物化学成分的予试验；⑵中药中已知有效成分的鉴定（须用已知标准品或对照品进行对照）；⑶分离得到的有效成分或单体的纯度判断；⑷小量样品的制备；⑸探索柱层析分离的条件。薄层层析优点：⑴价廉、设备简单、易于操作；⑵展开时间短，一般只须数分钟到期数十分钟；⑶斑点扩散小，检出灵敏度高；⑷分离情况受温度影响小