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SNP分型冯静2012.06.19主要内容•SNP相关知识•SNP检测方法什么是SNP？•SNP(SingleNucleotidePolymorphisms)，单核苷酸多态性。•是基因组核苷酸水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性。•包括单碱基的转换、颠换、插入、缺失，其中最少一种形式在群体中的频率不小于1％。转换：嘧啶和嘧啶之间或者嘌呤和嘌呤之间的交换（A↔G，C↔T)颠换：嘧啶和嘌呤之间的交换(A/G↔C/T)•从理论上来看，每一个SNP位点都可以有3种不同的变异形式，形成转换和颠换两种变异，二者之比为2:1。•SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T(CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为T)。SNPsinHumanGenome•人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。•SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。大多数SNPs是单纯多态性，但也有一些与疾病的发生有关联，是决定人类疾病的重要遗传基础。正常血红细胞镰刀状血红细胞携带氧气能力降低，因而出现贫血症状谷氨酸缬氨酸镰刀状细胞贫血•不同人群中SNP的频率分布有差异，而这些差异可以代表某一人群的遗传差异。SNP研究将帮助我们寻找新的遗传病的致病基因或易感基因，认识人种、人群、个体间的遗传差异，疾病与个体差异的关系，以及个体差异对药物的耐药性存在的不同反应能力。•SNP是继人类基因组计划之后又一国际研究竞争新热点，是阐明基因组功能及特点的重要基础。HapMapProjectSNPs•单体型图（HapMap）：人类DNA序列中多态位点的常见模式图。•目的：建立一个免费向公众开放关于对人类健康和疾病以及对药物和环境的反应有影响的相关序列变异的关键信息。•确定超过一千万的人类基因组的SNPs，完成了约310万SNPs（≥5％）在270个样品中的分型。–Yorubans-Ibadan,Nigeria,Africa(YRI)–Caucasian-North&WestEuropeancestry;Utah,USA(CEU)–Japanese-Tokyo,Japan(JPT)–Chinese-HanChinese;Beijing,China(CHB)SNP研究策略全基因组研究（发现/筛选）精细定位（验证）候选基因/临床研究大样本分型高通量中通量低通量SNP研究技术路线数据分析参考国外文献同样课题的研究成果首选外显子和启动子关联分析单倍体型分析对目的基因特殊位置测序检测是否有新的SNP位点寻找tagSNP二代测序数据IlluminaBeadArrayAffymetrixSNP6.0筛选候选SNP区域确定SNP候选区域候选SNP大样本分型定位致病基因\易感基因TaqmanSNaPshotSequenomSNPs检测技术区分SNPs位点的原理方法基于杂交基于酶或PCR以构象为基础直接测序数据的检测分析手段凝胶分析技术荧光检测技术DNA芯片质谱检测技术测序、质谱、TaqMan、SNaPshot、HRM、Illumina芯片、……SNP检测技术1直接测序法•客户指定检测SNP位点•每个位点均需经过PCR扩增然后测序•能发现已知和未知SNP位点•操作简单，但工作量大，成本较高•适用于少数几个位点及样本的检测AGprimerLprimerR2Taqman探针法•针对每个SNP位点设计一对Taqman探针，用不同的荧光标记。•5’末端携有报告荧光基团,3’端标有荧光淬灭基团•Tag聚合酶具有外切活性•通过散点图显示结果•每个数据集代表一种基因型：纯合子、杂合子和无模板对照（NTC）探针法特点•准确度高•速度快、通量大•适合已知SNP位点，位点数量少，多样本（几千个）检测3SnaPshot方法单碱基延伸原理：在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。•同一位点不同等位基因的区分根据峰的颜色可知掺入的碱基种类•不同位点之间的区分根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的SNP位点。操作流程•目标区段扩增•PCR产物纯化•SNaPshot反应•ABI3730测序仪检测单重位点检测GGGAAAAASnaPshot多重位点检测不同位点的引物带不同长度的尾巴颜色代表不同基因型大小代表不同位点不同大小扩增产物技术特点•分型准确•多位点同时检测，每个反应可检测8-12个位点，适宜检测的位点数为8-50个•不受SNP位点多态性的限制•适用于多位点同时检测，样本数不受限制，可以是几十到几千4HRM(高分辨率熔解曲线分析)•在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光信号，荧光值随温度变化即熔解曲线。•DNA都有其独特的序列，包括长度、GC含量及碱基的互补性差异，这样每个DNA片段都有独特的熔解曲线形状。•根据曲线可以准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子。HRM特点•染料：饱和性染料，如LCGreen•仪器：在熔解曲线阶段，具有细微温度差异的高捕获率常规熔解曲线温度捕获范围：~0.2-0.5度高分辨率熔解曲线温度捕获范围：~0.1-0.02度检测原理技术优势•无需序列特异性探针•操作简便快速，成本低•可对未知位点进行筛查•较高通量5质谱检测（Sequenom）•质谱仪通过对物质分子量（质荷比）进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。•SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过实验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可。+Enzyme+ddNTPAGAllele1UnlabeledPrimer(23-mer)TAllele2UnlabeledPrimer(23-mer)CExtendedPrimer(24-mer)TExtendedPrimer(24-mer)C质谱法的优点准确：检测分子本质特征之一——分子量，没有其他标记；灵敏：pmol物质即可被检测出；通量高：2周最高可完成7万个反应；灵活：以384板形式，最高可至17重反应，无论样本和位点多少，都能灵活处理；便宜：引物常规长度，不带标记，多重反应，位点越多越便宜；污染小：一管式操作，反应体系在实验时始终在一个试管内。6IlluminaSNP芯片2020年9月IlluminaSNP应用策略•Infinium™WholeGenomeGenotyping全基因组检测适用于GWAS、CNV研究项目每张芯片有660K，1M，2.5M，5MSNP位点数据库：HapMapPhase1-3和1KPG(千人基因组计划）•GoldenGate™特定SNP位点检测适用于用户定制SNP研究（每个芯片可研究48-3072SNP位点）Linkage连锁分析（HumanandMouse)主要组织相容性（MHC）研究Panel肿瘤SNP芯片目前的主流分型芯片–InfiniumIIAssay–Human660W和Omni1，Omni1S，Omni2.5，Omni2.5S，Omni5–以HapMap1-3期数据库和1KGP数据库Infinium全基因组分型芯片InfiniumIIAssay单碱基延伸Twohaptens/colorsAWGAtargetBeadTCWholegenomeamplifiedDNASNP1SNP2SNP3-----SNPA-DNPC-BioC-BioA-DNPA-DNPC-BioSNP1SNP2SNP3-----SNPSignalGreen/RedTTGGGTabcWholegenomeamplifiedDNASNP1SNP2SNP3-----SNPA-DNPC-BioC-BioA-DNPA-DNPC-BioSNP1SNP2SNP3-----SNPSignalGreen/RedTTGGGTabcTTGGTGEx:SNP=rs123456GWGAtargetA/GWGAtargetA/GWGAtarget2020年9月目前主要产品人全基因组分型芯片：Human660W，HumanOmni1，HumanOmni1S，HumanOmni2.5，HumanOmni2.5S，HumanOmni5，中华牛高密度全基因组分型芯片（BovineHD，777962位点)犬全基因组分型芯片（CanineSNP20,22362位点）犬高密度全基因组分型芯片（CanineHD,170000左右位点）马全基因组分型芯片(EquineSNP50,54602位点）羊全基因组分型芯片(OvineSNP50,54241位点）猪全基因组分型芯片(PorcineSNP60,62163位点）玉米全基因组分型芯片(MaizeSNP50,56110位点）用户自定义SNP位点检测GoldenGate™检测—低中通量•可根据研究需要挑选SNP位点，制作探针组•芯片规格：48,96,384,768,1536,3072位点可选样本数为480的倍数2020年9月AGillumiCode’AddressAlleleSpecificExtension&LigationUniversalPCRSequence1UniversalPCRSequence2UniversalPCRSequence3’GoldenGate™检测--等位基因特异性延伸和连接GenomicDNA[T/C]Ligase[T/A]Polymerase特定SNP位点检测2020年9月AillumiCode#561AmplificationTemplatePCRwithCommonPrimersGoldenGate™检测--扩增Cy3UniversalPrimer1Cy5UniversalPrimer2UniversalPrimerP32020年9月/\/\/\//\/\/\//\/\/\/illumiCode#561illumiCode#217illumiCode#1024GoldenGate™检测--和独特的带IllumiCodeTM编码序列的芯片杂交/\/\/\//\/\/\/A/AG/GC/TSNP#561SNP#217SNP#1024GoldenGate技术2020年9月1536位点－384DNA样品实验数据•肿瘤相关SNP芯片（CancerPanel）选择约400个肿瘤相关基因的1400个SNP标记，信息来源于美国NIHSNP500肿瘤数据库。•主要组织兼容性研究芯片（MHCPanel）MHC(MajorHistocompatibilityComplex)主要组织相容性区域是一段4Mb的基因组序列，位于Chr6p21上，包含了160个基因。这些基因中有40%与免疫蛋白编码相关，其中也包括了白细胞抗原基因等。MHC芯片针对这一区域挑选了2,400个平均间隔2kb的SNP标记，对该区域的SNP进行检测。MHC芯片可广泛应用于免疫、移植、疾病等相关研究。AffymetrixSNPArray6.0•涵盖超过1,800,000个遗传变异标志物：包括超过906,600个SNP和超过946,000个用于检测拷贝数变化的探针。482,000个SNPs来自于前代产品500K和SNP5.0芯片；424,000个SNP包括了源来于国际HapMap计划中的标签SNPs，X、Y染色体和线粒体上更具代表性的SNPs,以及来自于重组热点区域和500K芯片设计完成后新加入dbSNP数据库的SNP；202,000个用于检测5,677个已知拷贝数变异区域的探针，这些区域来源的于多伦多基因组变异体数据库。744,000个探针平均分配到整个基因组上，用来发现求知的拷贝数变异区域.