核酸杂交技术-分子生物学

NucleicAcidHybridization核酸杂交技术主要内容核酸探针核酸杂交概念及原理核酸杂交的分类SouthernblotNorthernblotchipChIPonchip生物化学与分子生物学系一、核酸分子杂交的概念及原理核酸杂交:两个不同来源的、含有互补碱基序列的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程。核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃-30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核酸片段。核酸分子杂交技术原理二、核酸探针核酸探针（nucleicprobe）:带有可检测标记，能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一段核酸。核酸探针的质量（标记效率和特异性）是核酸分子杂交成功的关键。1.核酸探针的分类根据标记物的性质分：放射性标记:32P,35S,125I,3H。非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧光标记等敏感度高，半衰期短（32P14.3天，35S87.1天，125I60天，3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交），有辐射危害。根据探针中核酸的性质分：DNA(包括cDNA)探针RNA探针(包括cRNA)寡核苷酸探针肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）探针(1)DNA探针（包括cDNA探针）的优点：①这类探针多克隆在质粒载体中，易于扩增，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针较稳定（相对RNA而言）。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，能用于同位素和非同位素标记。(2)RNA探针：主要是细胞mRNA和病毒RNA探针。RNA探针和cRNA探针的特点：杂交反应效率高、易于降解、标记方法复杂。用途：用于检测DNA和mRNA，以及研究基因表达中的转录。cRNA探针：以双链DNA中与mRNA序列相同的一条链为模板转录得到的RNA链，其序列与mRNA互补，也称为反义RNA。采用化学合成的短链寡核苷酸探针,最常用的寡核苷酸探针有18-40个碱基。(3)寡核苷酸探针特点：①链短、序列复杂度低、分子量小，与等量靶位点完全杂交的时间短。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化。③一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉。2.探针设计的条件①被检基因结构清楚；②有明确的基因产物;具备下列条件之一，就可以设计、制备特异性基因探针。3.核酸探针的常用标记方法核酸探针的标记几乎总是先将底物标记相应的信号，然后利用核酸合成的方法合成具有标记信号的核苷酸链。Pol.substrateprobe切口平移法（nicktranslation）PCR法DNA快速末端标记T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端随机引物延伸放射性探针的标记由DNaseⅠ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNaseⅠ：在双链DNA上随机打开若干个单链切口，产生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’核酸外切酶活性(1)切口平移标记法（nicktranslation）随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段：5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性无5’→3’外切核酸酶活性（2）随机引物法（randompriming）产物平均长度为400-600个核苷酸。Klenow片段没有5’→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。生物化学与分子生物学系(3)末端标记法用途：制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);DNA末端修饰---缺失外切酶活性聚合酶活性无dNTPdNTPT4DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min乙醇沉淀法凝胶过滤法（G-50Spincolumn）探针纯化非放射性探针的标记生物素标记核酸酶标核酸半抗原标记核酸根据标记物的性质分：根据标记方法分：酶促反应标记法化学修饰标记法以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成的DNA。可以采用切口平移法和随机引物延伸法进行。生物素标记——酶促法基本原理：光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活化为芳香基硝基苯，很易与腺嘌呤N7位氨基特异结合，形成生物素化的核酸探针。生物素标记——化学修饰法（光敏法）基本原理：酶标法使用交联剂戊二醛将辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记在DNA上，再通过酶促反应使其无色底物转变成有颜色的产物酶标法碱性磷酸酶(AP)：BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝）NBT（四氮唑蓝）酶标法辣根过氧化物酶(HRP)：DAB（二氨基联苯胺）→棕色TMB（四甲基联苯胺）→蓝色地高辛（Digoxigenin，DIG）即异羟基洋地黄毒甙，是一种类固醇半抗原，来源于植物（Digitalispurouren和Digitalislanta）的花和叶中。DIG可以与dUTP反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。地高辛标记基本原理：三、核酸分子杂交的类型核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。以上两种类型根据具体的杂交方式，反应条件等又可以分成多种类型。概念：参加反应的一条核酸链被预先固定在固相支持物上，另一条核酸链则游离在溶液中进行的杂交反应。固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板，芯片等1.固相杂交分类：①杂交后，游离片段容易经漂洗除去；菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。固相杂交的特点：②支持物上留下的杂交物容易检测；③能防止靶DNA自我复性。因此，该法最为常用。常用杂交方法介绍基本原理：是1975年由英国人Southern创建，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离，然后将DNA从凝胶中转印至滤膜上与探针杂交。通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（一）、Southern印迹（Southernblot）提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影预杂交tissueSDSProKPhenolCHCl3ETOHpptSpin1、提取基因组DNASDS使组织蛋白与DNA分子分离蛋白酶K消化分解蛋白质酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，乙醇沉淀纯化DNA加入EDTA能抑制DNase的活性，RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段。2、限制性核酸内切酶切断DNA基因组DNA很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。一般选择一种限制酶来切割DNA分子。有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活内切酶。样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品。3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构为了有效地实现DNA片段转移，最好将DNA片段控制在2kb以下。若DNA片段大于15kb，将电泳凝胶浸泡在0.25M的HCl溶液约10分钟作脱嘌呤处理，打断DNA片段。将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4、将DNA转移至尼龙膜将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各DNA片段的相对位置不变。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等。a．处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，膜切角。b．去离子水完全润湿膜，浸入变性转移液至少5分钟。c.制作转印“三明治”，用玻棒赶出其间滞留的气泡。d.DNA转移持续进行8-24小时。重物玻璃板吸水纸滤纸NC滤膜凝胶滤纸支持物转移缓冲液毛细管虹吸转移法尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极电转移法真空转移法5．膜的洗涤、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH7.2）、1MNaCl中，室温浸泡15分钟，除去粘附的琼脂糖。2）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥30分钟以上。3）DNA固定：在真空烤箱或普通烘箱内于80℃烘烤0.5－2小时。6.探针标记和预杂交预杂交：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。预杂交液：含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针杂交）、牛血清等。southern印迹杂交炉用杂交袋封装。每平方厘米NC膜需预杂交液0.2ml。鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性，保持单链。变性的鲑鱼精DNA加至终浓度200μg/ml。42℃水浴中温育4h。7、杂交、洗膜加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链DNA分子）。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。8、放射性自显影检测（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片。Southernblot是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southernblot的应用血迹中的DNADNA指纹分析基本原理：将RNA标本经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。（二）、Northern印迹（northernblot）注意：A甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性,不能用NaOH（会使RNA水解）。B样品RNA变性后进行电泳分离。C转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗D胶中不能加EB（影响RNA与硝酸纤维素膜的结合）RNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光甲醛变性电泳：RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶。在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。四、核酸分子杂交实验因素的优化探针的类型、标记方法和浓度杂交反应温度杂交反应时间杂交促进剂根据不同的杂交实验要求，选择不同的探针：1.探针的选择检测单个碱基改变：首选用寡核苷酸探针；检测单链靶序列：选用与其互补的DNA单链探针（M13噬菌体）或RNA探针，寡核苷酸探针也可；长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交视个人的习惯和可利用条件而定，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。通常，放射性探针比非放射性探针灵敏度高；在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法；在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶检测系统。2.探针的标记方法3.探针的浓度探针浓度增加，杂交率增加；在较窄的范围内，探针浓度增加，敏感性增加。膜杂交中，放射性探针与非放射性探针的用量分