大肠菌群检测(MPN法)

大肠菌群计数MPN法一群在36℃培养48h可发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。并非分类学概念，在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群（Coliforms）指在44.5℃培养24-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”，如NMKL。与大肠菌群一样，并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。粪大肠菌群（Fecalcolifoms）一群在44.5℃发酵乳糖、产酸产气、IMViC生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性无芽孢杆菌。分类学概念：肠杆菌科、埃希氏菌属是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。O抗原（菌体抗原，150个）K抗原（荚膜抗原，90个）H抗原（鞭毛抗原，50个）大肠杆菌（Escherichiacoli）致泻性大肠杆菌能侵入肠粘膜上皮细胞，引起食物中毒的大肠杆菌。产毒性大肠杆菌（ETEC)——肠胃炎、旅行性腹泻致病性大肠杆菌（EPEC)——婴儿腹泻肠出血性大肠杆菌（EHEC)——出血性结肠炎（O157：H7；O104：H4；O111；O26等）侵袭性大肠杆菌（EIEC)——杆菌性痢疾粘附性大肠杆菌（EAEC)——急慢性腹泻大肠杆菌（Escherichiacoli）ETECEIECEHECO157：H7；O104：H4等大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的关系是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等），因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系。通常情况下，粪大肠菌群与大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，粪大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，粪大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。食品卫生学意义检样稀释月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h不产气产气煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）36±１℃，24~48±2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性报告GB4789.3-2016（第一法）大肠菌群计数MPN法流程图大肠菌群计数MPN法示意图复发酵产气管10mLBGLB接种25g移1ml移1ml101225ml生理盐水均质器102103各1ml初发酵各1ml各1ml9ml生理盐水9ml生理盐水各10mLLST固体样品液体样品225ml生理盐水玻璃珠25mL其他相同0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（-）小导管里无气泡LST产气（+）MPN法大肠菌群计数MPN法操作根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是样品中活菌数的真值。阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限0003.0-9.50013.00.159.61003.60.17183331100420-根据大肠菌群阳性管数,查MPN检索表，报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。结果报告归纳总结培养基主要成分作用①月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长，同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况的观察变得有些困难；②乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌；③胰蛋白胨提供基本的营养成分；④LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越性。月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）归纳总结培养基主要成分作用①胆盐可抑制革兰氏阳性菌。②煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的抑制作用。③乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。④发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为黄色，同时可看到管底通常有沉淀。煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）归纳总结注意事项目前很多产品大肠菌群标准要求单位为MPN/100mL（g），同2010版检测结果单位MPN/100mL（g）不一致。中华人民共和国卫生部公告2009第16号正式公告：现行食品标准中规定的大肠菌群指标以“MPN/100克或MPN/100毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》（GB/T4789.3-2003）进行检测；以“MPN/克或MPN/毫升”、“CFU/克或CFU/毫升”为单位的，适用《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》（GB/T4789.3-2008）进行检测。归纳总结注意事项固体样品大肠菌群检测流程液体样品大肠菌群检测流程大肠菌群单位MPN/100克或MPN/100毫升的产品，建议选择取样量1mL（g）×3、0.1mL（g）×3、0.01mL（g）×3归纳总结注意事项大肠菌群标准要求不超过29MPN/100mL产品,建议检测流程为：根据阳性管数,查MPN检索表（03版）值除以10，报告每100g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。粪大肠菌群计数MPN法根据阳性管数,查MPN检索表，同大肠菌群。不产气检样25g(ml)+225ml稀释液，均质10倍稀释选择3个连续稀释度样品匀液接种LST48±2h36℃±1℃产气EC肉汤45℃±0.2℃24±2h不产气产气粪大肠菌群阳性管查MPN表，报告结果大肠杆菌计数MPN法检样25g(ml)+225ml稀释液，均质10倍稀释选择3个连续稀释度样品匀液接种LST48±2h36℃±1℃不产气产气EC肉汤45℃±0.2℃24±2h不产气产气EMB琼脂平板36℃±1℃24±2h营养琼脂斜面培养IMViC生化试验，革兰染色查MPN表，报告36℃±1℃24±2h靛基质试验(吲哚试验)(I)阳性甲基红反应(MR)阳性阴性V-P试验(VP)阴性阳性阴性柠檬酸盐利用试验（C）革兰氏染色G-