固定化酶和固定化细胞

CompanyLOGO固定化酶和固定化细胞CompanyLogo固定化酶的定义所谓固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。CompanyLogo1916年，Nelson和Griffin发现酶的固定化现象；1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称ImmobilizedEnzyme；1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。酶固定化技术发展史CompanyLogo从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。发展现状CompanyLogo固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。CompanyLogo固定化酶的制备原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。CompanyLogo（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。CompanyLogo固定化酶（细胞）的制备方法酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）CompanyLogo、吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。CompanyLogo物理吸附法(physicaladsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键。物理吸附法常用的载体：有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。物理吸附法CompanyLogo离子吸附法(ionadsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。离子吸附法CompanyLogo离子吸附法常用的载体：阴离子交换剂：DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。CompanyLogo、包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。CompanyLogo（1）凝胶包埋法将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。CompanyLogo（2）微胶囊包埋法微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。CompanyLogo、共价键结合法共价键结合法(covalentbinding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。CompanyLogo（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。（3）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。（4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲哚基。酶蛋白上可供载体结合的功能基团酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。CompanyLogo载体活化的主要反应重氮法叠氮法溴化氰法芳香烃化法CompanyLogo（1）重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。CompanyLogo（2）叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。CompanyLogo（3）溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。CompanyLogo（4）烷基化和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。CompanyLogo优点：共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当牢固，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上脱落下来，具有酶稳定性好、可连续使用较长时间的优点。缺点：载体活化的难度较大，操作复杂，反应条件较剧烈，制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶蛋白空间构象变化。CompanyLogo、交联法交联法（cross-linking）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物等。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。CompanyLogo各种固定化方法的比较吸附法物理吸附法离子吸附法包埋法共价键结合法交联法制备易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收率高，但酶易流失高高低中等再生可能可能不可能不可能不可能固定化成本低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变CompanyLogo、选择性热变性法专用于细胞固定化。是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。CompanyLogo、固定化活细胞将活细胞限制或定位于特定空间位置的方法。CompanyLogo无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。固定化活细胞的优越性CompanyLogo缺点必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会形成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。CompanyLogo制备方法固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。CompanyLOGO固定化酶的特性CompanyLogo固定化酶的形状固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒状、纤维状、酶膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和纤维状主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应。CompanyLogo固定化酶的性质酶活力酶稳定性酶学特性CompanyLogo固定化酶的酶活力固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合；高级结构和空间构象的改变；空间位阻的影响；内扩散阻力；半透膜的隔离。个别情况下，酶经固定化后其活力升高。CompanyLogo固定化酶的稳定性操作稳定性：体内半衰期贮藏稳定性：低温放置热稳定性：耐热性提高对蛋白酶的稳定性：空间位阻其他：对有机溶剂、pH、酶抑制剂等的稳定性均有提高。CompanyLogo固定化酶的酶学特性底物特异性：对高分子底物的活性明显下降；最适pH：最适pH和pH曲线常会发生偏移；最适温度：多数较游离酶高；动力学常数：Km均增大，增大幅度视情况而定；最大反应速度：与游离酶大多数是相同或相近。CompanyLOGO酶反应器及其类型CompanyLogo酶反应器的定义以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶反应器。CompanyLogo酶反应器的类型间歇式搅拌罐反应器，BSTR连续流动搅拌罐反应器，CSTR填充床反应器，PBR流化床反应器，FBR连续搅拌罐-超滤膜反应器，CSTR/UFR循环式反应器，RCRCompanyLOGO反应器的结构特点CompanyLogo这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。常用于游离酶。BSTR间歇式搅拌罐反应器，BSTRCompanyLogo