免疫化学诊断技术的进展

免疫化学診斷技术的进展AutomatedChemiluminescenceSystem利用抗原抗体反应和分离技术测定(量)与疾病有关的化学分子。免疫化学診斷技术免疫同位素标记測定法化学发光法酶联化学发光偏振荧光时间分辨荧光电化学发光直接化学发光免疫化学診斷技术的分类免疫同位素标记測定法放射免疫法已有30多年历史。比较其它传统的方法，它有特异性好，灵敏度高，准确性好，可靠性强等特点，故在临床科研上广泛使用。免疫同位素標記法之局限半衰期短；試劑批內与批間差异大；反應過程長；靈敏度有限；放射性廢物的處理；免疫化学发光法酶联化学发光偏振荧光时间分辨荧光电化学发光直接化学发光免疫化学发光法简介-酶联化学发光(EMCLIA)原理：¶抗体包被的塑料固相¶加入待测样本-抗原¶加入碱性磷酸酶标记的抗体¶洗¶加入底物-4-Mup,发光产品：¶雅培Axsym,梅里埃Vidas,强生Vitros,¶DPCImmulite2000,罗氏ES300原理：¶標記在小分子抗原上的熒光素經485nm的激發偏振光照射後，發出光子，經過偏振儀形成525~550nm的偏振光；¶這一偏振光的強度與熒光素受激發時分子轉動的速度呈反比，游離的熒光素標記抗原，分子小，轉動速度快，激發後發射的光子散向四面八方，因此偏振光信號弱；¶在測定過程中待測抗原小分子，熒光標記抗原小分子和特導性沆體大分子同時加入到一反應杯中，待測抗原越少，與抗體競爭結合的量越少，而熒光標記抗原與抗體結合就越多，而熒光標記的小分子抗原與大分子抗體結合後，其分子的轉動速度減慢，由此熒光偏振信號強。产品：雅培Axsym免疫化学发光法简介-偏振荧光(FPIA)原理：¶标记物为三價稀土離子如：銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)和鋱(Tb3+)等，它們可利用具有雙功能基團結構的螫合劑，在水溶液中與抗原分子以共軛雙鍵結合，形成稀土離子—螫合劑—抗原結合物。¶當標記稀土離子的抗原與待測抗原共同與抗體競爭結合，形成抗原抗體免疫復合物，其中含有標記稀土離子，然後利用時間分辨熒光分析儀，可測出復合物中稀土離子發射熒光的強度，以此確定待測抗原的含量。产品：–EG&G的DELFIA免疫化学发光法简介-时间分辨荧光(TRFIA)原理：¶先將特异性抗體包被在磁性微珠。另外將發光劑[Ru(bpy)3]2+標記在特异性抗體上。¶將待測樣本與包被抗體的磁性微珠和發光劑標記的抗體共同溫育，形成磁性微珠包被抗體—抗原—發光劑標記杭體復合物。¶加入TPA緩沖液和TPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光。产品：–罗氏Elecsys免疫化学发光法简介-电化学发光(ECLIA)免疫化学发光法简介-直接化学发光(CLIA)原理：利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術相結合的測定方法。以丫啶酯為發光的標記物，固相載體為極細小的磁性顆粒。其測定原理與放射免疫和聯免中的雙抗體夾心法和競爭結合法相似。¶單克隆抗體或抗原包被磁性微粒¶抗原抗體結合，洗滌分離¶加入氧化劑發光：經過加入氧化劑（H2O2）和pH糾正液（NaOH）使成鹼性，這時丫啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發光，集光器和光電倍增管接收。記錄5秒鐘內所產生的光子能。产品：–拜耳ACS:180SE,AdviaCentaur,AdviaIMS全自動化學發光系統拜耳ACS(AutomatedChemiluminescenceSystem)免疫化学发光法简介-直接化学发光(CLIA)直接化學發光的机理-ACRIDINEESTER丫啶酯最簡易最快速•非常稳定；•与抗体或抗原结合不影响发光；N+CH3BrCOOCH3CH3R丫啶酯：在pH10时，快速充分释放光子。丫啶酯-ACRIDINEESTER»不需催化劑»穩定性高»產光強»線性好»本底低»反應快»結合后不影響發光»靈敏度高-可達10-15摩爾直接化學發光的机理丫丫啶啶酯酯一一秒鐘直直接接閃閃光光，，強強度度是是碘碘125125在在一一分分鐘鐘發發出出光光子子的的十十万万倍倍06.05.02.01.00200,000400,000600,000800,0001,000,0003.04.0秒100200300400500600直接閃光慢發光光強度直接化學發光的机理直接閃光慢發光直接化學發光的机理由于超低本底,,直接化學發光具有高靈敏性TracerConcentration(moles/L)sensitivitylimitoffluorescencesensitivitylimitofchemiluminescenceFluorescenceBackgroundNoiseLevelChemiluminescenceBackgroundLevel1010998877665544332211001010-15.51010-171010-161010-151010-141010-131010-121010-101010-91010-81010-11RelativeLightIntensitytracersignal直接化學發光的机理直直接接化化學學發發光光不不受受pHpH和和溫溫度度影影響響nn減輕漂移減輕漂移nn提高重复性提高重复性00202040406060808010010012012088991010111112121313pHpHpHpHTemperatureDegreesCTemperatureDegreesC120120100100808060604040202000151520202525303035354040直接閃光慢慢發發光光直直接接閃閃光光慢慢發發光光RelativeRelativeLIghtLIghtIntensity(%)Intensity(%)溫溫度度RelativeLightIntensity丫啶酯直接發光CL(AE)電化學發光ECL(TU+TPA)信號的產生丫啶酯与H2O2的簡單反應需三個電板去激發由几個分子態參加的复雜反應速度不到2秒5秒，但洗電极需4060秒靈敏度10-15M，足以滿足免疫試驗的要求10-11-10-17M本底极低較高，過剩的TPA會發光特异性不受溫度与pH的影響受pH,金屬及螯合物影響直接化學發光与电化學發光比较丫啶酯直接發光CL(AE)電化學發光ECL(TU+TPA)信號的產生丫啶酯与H2O2的簡單反應需三個電板去激發由几個分子態參加的复雜反應速度不到2秒5秒，但洗電极需40-60秒靈敏度10-15M，足以滿足免疫試驗的要求10-11-10-17M本底极低較高，過剩的TPA會發光特异性不受溫度与pH的影響受pH,金屬及螯合物影響微顆粒粗顆粒Y功能–抗原抗体反應相–結合与未結合的分离特點–縮短擴散距离–提高捕獲效率–表面面積為包覆的試管和玻璃珠之50倍有利于結合動力學–提供更高之靈敏度微磁顆粒技術扁平的設計結合相磁場狄窄空間以利快速抽吸吸液探針以便最怏速,最干凈地分离結合物与未結合物以便獲得高靈敏度及高重复性試杯的最佳設計-配合微磁粒体技術降低人抗鼠抗体(HAMA)的干扰為大分子的測定提供了高靈敏度和高特异性單抗多抗直接發光FSH超廣磁粒反应过程的结构设计-單-多抗体标记法是一种确保高靈敏度同時又廣譜的設計BGG血清結合蛋白T3AET3T3AET3T2T2T2BGGT2T2接發光反应过程的结构设计-抗体一步標記法磁颗粒ACS:180SE之特性隨机存取直接化學發光台型設計180測試/小時十五分鐘內首次結果自動重复功能自動机內稀釋凝塊識別兼容原樣品試管條碼識別60個樣品容量緊急樣品容納机上容納十三种項目試劑清單微量固相廢物質控報告儲存一小時离机雙向界面宿主詢問廣譜試驗項目系列實驗室自動化匹配臨床應用项目按疾病分類甲狀腺功能T4,T3,TUp,FT4,FT3,TSH,TSH-3生殖系統ThCG,LH2,FSH,Estradiol,Estradiol6-II,Progesterone,Prolactin,Testosterone內分泌Cortisol(serum+urine)貧血B12,Ferritin,Folate,RBCFolate心血管CK-MB,Myoglobin,TroponinI腫瘤標記CEA,AFP,PSA2,fPSA,CA15-3,CA125,CA19-9藥濃度監測Digoxin,Theophylline,Phenobarbital,Phenytoin,Vancomycin,Gentamicin,Digitoxin,Carbamazepine骨代謝Deoxypyridinoline過敏TotalIgE發展中新項目Insulin,C-peptide,anti-insulinDHEA-SulfateSHBGTobramycin,QuinidineHomocysteinebeta-2microglobulinE3Anti-TPOAnti-TGEquimolarPSAComplexPSAHER-2/neu免疫化學定量分析之進化2.5hours0.12U/mL79年IRMA50minutes.03U/mL88年半自動Magic7.5minutes.03U/mL91年ACS:1802days1.0U/mL70年代中商業化RIA5days1.0U/mL60年代初研究RIA以TSH甲狀腺刺激素試驗為例免疫化學方法靈敏度之提高10-16M10-11M10-12M免疫熒光免疫媒標放射免疫直接化學發光10-11-10-17M免疫傳感技術免疫PCR技術?M電化學發光免疫熒光偏振ACS:180系列發展史1974-首創微玻璃珠放免法1978-首次FT4放免法1979-首次TSH放免法1982-首次維生素12/葉酸固相法1983-MAGIC上市1986-首次直接化學發光免疫分析儀-MAGICLITE1991-首次全直動隨机存取之化學發光免疫分析儀-ACS1992-首次全直動維生素12/葉酸測定1993-延長操作附件1994-首次凝塊探測功能1994-ACS通過ISO9001標准心血管系统如何能更快更准确更全面的诊断AMI时心电图并不能典型归类诊断急性心肌梗塞之困难•一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入院•病人重发梗塞诊断困难引致不能及时诊断AMI延迟适当的治疗、护理•临床需要尽早分辨、准确诊断AMI方法肌肉组织心肌心肌细胞特异性标志肌钙蛋白ICT肌钙蛋白I释放入血c心肌坏死（氨基酸顺序40％差异）心肌细胞肌红蛋白肌酐激霉MB心肌坏死释放入血（含量大）血液浓度明显升高(CK-MB)65432104812162024487296h肌红蛋白CK-MB肌钙蛋白浓度急性心肌梗塞后各项指标变化肌红蛋白升高高峰回落肌酐激霉MB肌钙蛋白I1-2h4-8h6-8h5-12h10-24h12-24h18-30h48-72h5-7d肌红蛋白的临床意义•早期诊断•特异性低•灵敏度高急性心梗后最早(1-2h)出现的标记最早能排除非急性心梗阴性预测率为99%体内周期短，对重发梗塞特别灵敏肌红蛋白测定能有效分辨非急性心梗，使急性心梗病人能尽早得到治疗.有效观察溶栓疗效肌钙蛋白I的临床意义诊断急性心肌梗塞特异性98%•特异性强、确诊率高•灵敏度低急性心梗发病后6h才出现，应与肌红蛋白一同使用肌钙蛋白I升高即可确诊为急性心肌梗塞，得到治疗体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断对极轻微的心肌创伤都能检出胸痛ECG发病肌钙蛋白I肌红蛋白CK-MB急性心梗+–++8h8h随访+复发心梗肌红蛋白注意事项肌酐激霉MB•骨骼肌损伤肌红蛋白升高•肾功能衰竭CK-MB增高甲状腺功能诊断•T3•T4•TSH•TSH-3•FrT3•FrT4•Tup肿瘤标志物•CA-199•CA-153•CA-125•PSA•AFP•CEACA系列一组糖粘蛋白类肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因分别被鼠单克隆抗体199、153、125识别得名。乳癌肿瘤标志物存在于胎儿胰、肠、卵巢、子宫