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免疫组织化学技术西南医院病理学研究所冯俊明•免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。•近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病，尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异，而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化技术，审慎判断其标记的意义。免疫组化标记的形态学特征•免疫组化标记具有形态学特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断，现择要分述如下：一、阳性标记色度特征•免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外，可能与细胞只有轻度异常表达，或某些细胞摄取了周围组织抗原之故。二、阳性标记细胞学特征•免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞中的定位和分布情况。在诊断中阳性细胞以拟标记的细胞为前提，阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据。根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下5种类型：•1.胞膜型阳性颗粒主要分布于细胞膜表面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。此类型常见于某些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）和Ki-1等。•2.胞核型阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀分布或位于核膜下，有的呈小斑块状不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等。•3.胞浆型阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型，如细胞角蛋白、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧。•4.微绒毛型抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛，而胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌，如甲状腺腺癌、乳腺腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌、卵巢浆液性腺癌等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外，其余基底部可呈阴性反应。在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等。甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现。•5.复合型在常规免疫组化标记中，同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞浆同时阳性。三、阳性标记组织学特征•根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列：•1.局灶型阳性细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染色深浅不一。细胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤；肌动蛋白和结蛋白在低分化横纹肌肉瘤；NSE、神经丝蛋白、突触素在恶性神经内分泌肿瘤及低分化星形胶质细胞瘤中胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和恶性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表现为局灶性阳性。•2.弥漫型阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连接，也可以单个细胞散在分布。此型中细胞几乎都高度表达某种抗原，如淋巴瘤（白细胞共同抗原）、Hodgkin病（粒细胞相关抗原、Ki-1）、胃肠未分化癌癌胚抗原（CEA）及上皮膜抗原、尤文瘤中CD99等。•3.片块型较常见。阳性细胞多为细胞浆表达，细胞间界限较清晰，但相互融合呈片状或团块状结构。此型可见于上皮源性肿瘤、某些向上皮分化的间叶源性肿瘤、恶性黑色素瘤、中分化神经内分泌瘤及核形细胞瘤（如癌肉瘤和神经纤维瘤、平滑肌肉瘤）。•4.网状型此型主要见于细胞密度较大的大细胞肿瘤，标记物多为膜抗原。阳性细胞膜与膜间相互紧靠，而胞核呈阴性反应，免疫组化标记显示网状结构。•5.腺管型主要见于腺癌和具有腺癌样结构的胚胎性肿瘤。上皮标记物多为胞浆表达。胃肠低分化腺癌中有时HE很难鉴别腺样结构，但用癌胚抗原、上皮膜抗原或结肠癌相关抗原则容易显示出来。•6.腔缘型阳性颗粒主要位于腺癌腔缘的微绒毛处，沿腺管腔缘表面内衬一薄层黄色颗粒，基底部多为阴性。结肠癌相关抗原在胃肠腺癌、胆囊腺癌、乳腺癌中常表现为这种类型；卵巢癌相关抗原在卵巢浆液性腺癌亦是如此；肿瘤相关粘液抗原在许多腺癌中也显示腔缘阳性。•7.菊团型阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型多见于分化较好的神经内分泌肿瘤和胶质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆。四、阳性标记强度特征•细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性细胞50%。五、非特异着色特征•以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：（1）抗体交叉反应：是由于该抗原决定簇同时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反应只要应用得当仍有助于诊断。•（2）肿瘤细胞异常表达：可选用多种标记去证实或排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织细胞分化。•（3）肿瘤细胞吞噬组织抗原：是由于某些恶性肿瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分，虽然后者也存在某些抗原，但不属于瘤细胞固有成分，胞浆内抗原定位较模糊，因此应该区别。•（4）非特异性染色是指抗原无明确定位，肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄色，相互累及一片，色度无深浅之分。这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断依据。•非特异性染色的原因常为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，如前所述，阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞间的不均一性染色，即是呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊断依据。免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识•一、免疫组化结果的判断原则免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但随着免疫组化应用的普及和深入，越来越多的问题也随之出现。因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。•1.必须设染色对照每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确的判断。没有阳性对照，就不能做出真正阴性结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信的。•2.抗原表达必须在特定部位阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。3.阴性结果不能视为抗原不表达即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。4.免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。二、引起假阴性和假阳性结果的原因1.假阴性结果的原因主要是：（1）抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度；（2）由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本；（3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高；（4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。2.假阳性结果的主要原因是：（1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现；（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合；（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色；免疫组化操作经验和体会•操作中应注意以下问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗涤要充分。4.要设阴性和阳性对照。5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC复合物应在临用前30min配置。8.ABC试剂保存温度以4℃为佳，保存达数年仍可获满意效果。9.抗体保存：-20℃分装冻存，或于4℃常规使用，切忌反复冻融。（一）均匀的背景染色1.酶-底物反应时间过长。2.在孵育中切片干燥。3.一抗或二抗稀释度不够。4.切片洗涤不充分。5.封闭所用的正常血清不对。免疫组化常遇问题（二）部分区域背景着色1.切片部分区域干燥。2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。（三）部分区域不着色1.脱蜡不完全。2.切片部分区域干燥。（四）各种孵育结果所有抗体均不着色1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封片液中。（五）某些抗体不着色1.需要消化而没有消化。2.封闭内源酶时使抗体活性下降。3.切片在裱片或干燥时过热。4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。5.抗体过期或频繁冻融.（六）内源性酶活性：H2O2-甲醇封闭不恰当。（七）脱片1.切片无粘附试剂。2.切片不干净。3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。（八）核轮廓模糊1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。2.苏木素染液欠佳。（九）非特意性色淀1.底物-显色液使用前未经过滤。2.抗体使用前未离心。（十）阳性反应太弱1.抗体或其它试剂活性下降。2.显色反应时间过短。3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。4.当加抗体时切片上缓冲液过多。（十一）切片镜下模糊或黑点沉着1.脱水不彻底：进入二甲苯前加一步等量石碳酸/二甲苯混合液。2.温箱干燥替代脱水过程。谢谢！请多指教！