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FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-FreeSrvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况三仪器设备及耗材（一）仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075MKcl、1MHcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。（二）各种溶液的配制2.1：制NaOH溶液a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。b)用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。c)摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。d)然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。2.2：配制20XSSC溶液：取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。2.3：配制2XSSC溶液：用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0,封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制50ml20×SSC(pH5.3)0.5mlNP-40449.5ml双蒸水500ml调pH为7.0,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。2.5：系列酒精的配制取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。2.6：PBS缓冲液：PBS1L配方（pH7.4）：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高压灭菌后室温保存。2.7：0.075MKcl低渗液：钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl2.794g溶入500ml去离子水中），备用，4摄氏度低温保存。2.8：固定液：按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液，细胞固定液现配现用。2.9:1MHcl：取.9ml浓Hcl加去离子到100ml混匀，4℃保存备用。保存1个月。2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液：A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。B：次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1MHcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。2.11:200ug/mlPK工作液：aPK储存液（20mg/ml）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。b蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。五实验步骤（一）：羊水样本FISH实验SOP一：标本预处理①：将新鲜收集到的羊水（10ml）细胞1500rpm离心8min。（转速可调至1500至2000范围内）。②：去上清，加入5ml0.075Mkcl低渗液。混匀，后放入37℃水浴30min。（作用：利用渗透压差使细胞膜破裂，细胞核吸水膨胀。利于探针的杂交。）③：加入2ml固定液预固定，（甲醇：冰乙酸=3:1），混合均匀后1500rpm离心8min。(固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有极强的细胞穿透能力，在瞬间杀死细胞，使细胞固定在低渗后的膨胀状态，保证细胞中需要检测的物质不被破坏。)④：去上清，加入5ml固定液固定，混合均匀后1500rpm离心8min。⑤：去上清，加入5ml固定液，混匀后于-20℃保存。二：样本处理：①：取出预固定好的羊水标本，1500rpm离心8min。去上清，加适量固定液（10ml的羊水样本，根据细胞的多少，一般留1ML左右的固定液），②：吹打混匀后吸取少量细胞固定液滴片（滴片前一定要将细胞吹打散开，滴片时保证细胞均匀散开，不要太密集，也要保证有足够计数的细胞）。自然晾干，56℃烤片30min。（防止掉片）③：将上步所得玻片置于37℃2XSSC溶液中浸泡10min。(洗涤玻片，增加细胞核的通透性，模拟细胞的生理环境，保证细胞被检测物质的稳定性。)④：将玻片置于37℃40ml胃蛋白酶工作液中15min。（消化细胞中的各种蛋白，增加组织通透性，便于探针杂交）。⑤：室温下将玻片于70%、95%乙醇中各脱水2min（梯度脱水）。自然干燥玻片，三：变性，杂交：①：室温（暗室）下按探针：缓冲液=2:8的比例配制探针混合物，放入200ulEP管中，充分混匀，离心1-3S.②：将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，用封片胶封片（保证杂交环境湿润状态。③准备杂交仪，75℃5min变性，42℃16h杂交过夜。（杂交仪使用前添加去离子水到保湿材料上。）等二天：①：用镊子取下封片胶和盖玻片。（如果盖玻片不好下，可以先在2XSSC中浸泡下再去掉）。②：玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。③：于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。晾干。（NP-40（乙基苯基聚乙二醇）是一种裂解液，去垢剂，非离子表面活性剂，根据浓度不同，作用不同，可以看作是聚乙二醇(PEG)的衍生物，1%浓度时能很好地消化细胞膜，但对核膜没有影响，作裂解液时是一种温和的裂解液，(相对于阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）而言。)）④：复染：将15ulDAPI加入杂交区（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。备注：a加探针后所有操作均应该在暗室环境下，b杂交温度的选择。在37℃-45℃均可进行，选择42℃是因为37℃时杂交灵敏度高，但太多非特异性杂交。45℃杂交特异性高，但灵敏度降低。选择中间42℃比较适宜。c在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。所以同样的样本及探针在冬天更应该注意温度的控制，或者适当延长浸泡洗涤及消化时间。d直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。e在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。f0.1%NP-40/2XSSC洗涤非特异性杂交信号时，也洗掉没有杂交上的探针。g用于实验的2XSSC、.01NP-40/2XSSC洗液、胃蛋白酶工作液、0.01MHcl、固定液、酸性亚硫酸钠和蛋白酶K工作液不可反复使用。（二）：血液样本FISH实验SOP一：样本预处理：①用移液器取取2ml血液（抗凝血）（最好24小时内处理）（血液样本根据检测项目的不同，病灶部位的不同，临床医生抽取患者不同部位的血，如：检测MM：抽取骨髓血，检测CML(慢性粒细胞白血病)，抽取外周血。加入10ml离心管中，加入5mlPBS缓冲液，洗涤，1500rpm离心8min。（在模拟细胞生理环境下对细胞进行洗涤。）②：去上清。加入5ml低渗液，37℃孵育20min，期间吹打细胞2-3次。（使红细胞破裂）③：加入2ml固定液，预固定，1500rpm离心8min。④：去上清加入固定液，反复固定、离心至固定液颜色由深变浅。-20℃保存。二：样本处理：①：将细胞固定液1500rpm8min。去上清，加入适量固定液，滴片。②：自然晾干，56℃30min烤片。③：于37℃下2XSSC中洗涤20-30min。于胃蛋白酶工作液中洗涤8min。2XSSC中洗涤5min2次。④：（暗室）探针：缓冲液=2:8，加探针于杂交区，盖片，封边。⑤：78℃变性5min。42℃16h杂交过夜。等二天（暗室）：①用镊子取下封片胶和盖玻片。（如果盖玻片不好下，可以先在2XSSC中浸泡下再去掉）。②玻片洗涤（暗室环境）。将玻片于48℃2XSSC溶液中震荡1-3S,漂洗8min。DOUBLE。③于48℃0.1%NP-40/2XSSC中漂洗5min。室温下于70%、95%乙醇中脱水各3min。④甩干后自然晾干玻片，向杂交区加入15ulDAPI，盖上大盖玻片，（DAPI是一种细胞核染料，能够使细胞核在激发光激发下发出蓝色荧光），盖上盖玻片，20min后于荧光显微镜下观察。（三）：石蜡组织样本FISH实验SOP一：样本预处理②将组织切片置于65℃下过夜烘烤，老化玻片。③将组织切片浸泡于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min。（或置于一瓶二甲苯中脱蜡20-30min）。随后浸入100%乙醇中5min。（无水乙醇洗涤二甲苯）。③：将组织切片依次室温100%、85%、70%乙醇中各2min（梯度复水）。④：将切片放入去离子水中90℃孵育30min。（或者：50℃下用30%[w/v]酸性亚硫酸钠（sodiumbisulfite）处理组织切片20－30分钟。）（去除核酸表面的蛋白质，增加组织的通透性，利于探针的杂交）。⑤：取（3.2mgX3=9.6mg）胃蛋白酶加入40ml0.01Mhcl得胃蛋白酶工作液。37℃孵育25-30min。（亦可用200ug/mlPK10min代替,虽PK工作液的时间短，但容易消化过度。）⑥：于2XSSC溶液中漂洗2次，每次5min。⑦：将漂洗完的玻片浸入放有2.5%甲醛的PBS缓冲液中（1ml甲醛加入39ml的PBS缓冲液中）中10min（*此步骤可以省略，不影响信号质量，而且甲醛为高毒性物质。故一般不用。）。⑧：将玻片一次置于70%、95%乙醇中各2min，自然晾干玻片。⑨：按探针：缓冲液=2:8配探针混合物，将10ul探针混合物滴于玻片杂交区域，加盖小玻片，封片。于杂交仪上82℃变性5min