生化反应曲线

1生化反应曲线2生化分析基本原理生化反应曲线内容概况3罗氏生化分析系统产品线Cobas6000(c501)600T/HModularD2400T/HModularP800T/HCobasc311300T/HCobasc111180T/HCobas80002000T/H4cobas®8000模块化组合分析系统智能、高效、强劲5物质对光吸收的基本定律－Lambert-Beer定律Lambert－Beer定律表达为:当一束平行的单色光通过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正比。物质对光吸收的吸光系数（e）为常数。☆其数学表达式：A=e*C*LI透射光I0==-------光吸收的基本定律=lightdetector6根据Lambert-Beer定律来计算待测物浓度如若吸光系数(ε)未知，我们就需要采用定标曲线来计算待测物的浓度。浓度(amountofsubstance)吸光度(amountofcolor)40123456706050302010Calibrator/standard标准品(cfas)待测样本Concx=ΔAbsxxConcsAbssConcx=待测样本浓度Concs=标准品浓度ΔAbsx=样本吸光度Abss=标准品吸光度此值为定值7Lambert-Beer定律适合于任何均匀非散射的介质生化比色分析特定蛋白透射比浊分析Lambert-Beer定律分光光度法定量分析的依据8RocheHitachiPhotometer9当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。12有效波长:340,376,415,450,480,505,546,570,600,660,700,800nm多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果的影响）Reactionsequence100100020003000400050006000700013579111315171921232527293133353739414345474951535557596163656769AbsorbanceCyclesReactionMonitorTrigprimaryλ11BichromaticDifference0100020003000400050006000700013579111315171921232527293133353739414345474951535557596163656769cyclesAbsorbanceBichromaticDifference12仪器读数的原理不同仪器每个循环周期的时间间隔ModularP18秒Cobasc70216秒CobasC5018秒ModularD12秒C31112秒反应转盘不停的周期旋转当相应的比色杯通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度在不同的时间点加入相应的反应试剂13Reactionsequence14ModPC501C702Samplepipetting1st1st1stT0=0minReagent11st1st1stT1≈0min2ndreagent5th11th7-8thT2(≈1.5min)3rdReagent16th34th19-20thT3(≈5.0min)4threagent33rdn/an/aT4(≈10min)时间CycleNoInstrumentcycle15Endpointandrate(kinetic)assays自动生化分析常用的方法有:终点法（EndPointAssays）：一般在整个反应完成后再来检测吸光度速率法（Rateassays）：一般在反应的过程中监测吸光度的变化情况16终点分析法时间吸光度A1tS+R1基于被测物质在反应过程中到达反应终点或平衡点，根据该点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。•终点法的计算：从时间-吸光度曲线来看，到达反应终点时，吸光度将不再变化。在达到终点时任取一点进行测定，此时底物和产物的量都不再变化。吸光度A1S+R1吸光度17两点终点法（2-pointend）一点终点法（1-pointend）一点终点单试剂（1-pointendpointassay–onereagent）一点终点双试剂（1-pointendpointassay–tworeagents）三点终点法（3-pointend）终点分析法（Endpointassays）18两点终点法在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。19去除了样本的本底采用两个测量点针对两个或多个试剂的项目第一个读数点一般选在添加最后一个试剂之前第二个读数点一般选在加入最后一个试剂之后且已经达到了反应终点两点终点法的特点C+D(显色产物)+B1(试剂1)+B2(试剂2)A(样本)Endpointassays20两点终点法的反应曲线–Cobasc702EndpointassaysSample+R1Mp1absbeforeadditionofR3Mp2absatreactionend21两点读数的时间点:第19点测量包含了样本和试剂1的本底sample+reagent1第38点在加入所有试剂后，反应达到终点sample+reagent1+reagent2两点终点法的应用参数–Cobasc702测量的两个读数点方法类型总反应时间（min）2PointEndpointassayapplicationsettings22RF-IIC4C3ASLCRPLIGGIGAIGM两点终点法分析项目举例Endpointassays23一点终点法A单试剂一点终点法例如:CHOL/TG….在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。B双试剂一点终点法Mg(双试剂)…24单试剂一点终点法的特点（1-pointendpointassay–onereagent）不包含样本的本底仅进行一个点的测量检测项目举例：甘油三酯（TG）EndpointassaysA(样本)C+D(显色产物)+B(试剂)25单试剂一点终点法的反应曲线1-pointendpointassay–onereagentsEndpointassays26不包含样本的本底仅进行一点测量应用项目举例：Magnesium不采用两点终点法主要是样本和R1体积相加仍180uL(最小反应体积，无法测量）双试剂一点终点法的特点（1-pointendpointassay–tworeagents）C+D(product)+B1(reagent1)+B2(reagent2)A(sample)271stentry:方法类型2ndentry:总分析时间3rd-6thentry:测量点一点终点法应用参数（1PointEndpointassay）Utility-Application-Analyze28TRIGLCHO一点终点法分析项目举例Endpointassays29ABS151735t例如,多项同测组合试剂盒,CHO与TG同一测定即双终点法,在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定.三点终点法30上升increasing或下降decreasing终点法反应的方向（ReactionDirection）31速率法吸光度tt2t1t3t4△A1△A2△A3S+R时间A1利用线性反应期，计算出单位时间的吸光度变化△A/min，来计算酶的活性。单位时间的吸光度变化量是一致的在酶促反应过程中,在反应速度恒定期(线性反应期)来连续观察和记录一定反应时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法.32速率A法（RateA）两点速率法（2-pointRate）速率法（Endpointassays）33速率A法A单试剂速率法例如:ACP\AFUB双试剂速率法例如:ALT\AST\CK…在较长的反应时间区段内,每隔一定时间读取一次吸光度值,至少读取4点,得到3个△A,求出单位时间的反应速率△A/min.通过最小二乘法（leastsquaresmethod）34RateAassay–ModularPReag.atR3timingLastmp1st.mpSampleReag.atR1timingRateassays35GOT/ASTGGTGPT/ALTLipaseALPGLDHAmylaseLDHCHECKMB速率A法-分析项目举例EnzymesRateassays362点速率法2点速率法尿素氮指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。372-pointRateassayRateassaysC+D(product)+B1(reagent1)+B2(reagent2)A(sample)Enzyme38采用一种或多种试剂检测两个测量点检测固定的间隔时间内两点的吸光度变化。换算成Abs/min参与计算在加入最后最后一个试剂之后进行吸光度检测。两点速率法的特点2-pointRateassayRateassays392-pointRateassay–ModularPRateassays40AmmoniaAcidphosphataseNon-prostaticphosphataseUrinary/CSFproteinBicarbonateUreaRateassays2点速率法-分析项目举例41ReactionDirection上升decreasing或下降increasing生化反应曲线434445464748495051525354555657ThankyouforyourattentionRocheDiagnostics(Shanghai)LimitedShanghai200031ChinaThispresentationisourintellectualproperty.Withoutourwrittenconsent,itshallneitherbecopiedinanymanner,norusedformanufacturing,norcommunicatedtothirdparties.COBASandLIFENEEDSANSWERSaretrademarksofRoche