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微生物学与免疫学教研室【基本要求】1.进微生物实验室必须穿好白大衣，离室需脱下反折。2.实验无关物品一律禁止带入实验室。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。3.手拿培养物后或出实验室前要洗手；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告。4.实验操作过程中产生的废料要扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。21.实验室生物安全；“有菌意识，无菌操作观念”的树立。2.细菌的人工培养以及细菌的形态学检查（革兰染色）。3.细菌在自然界的分布，消毒灭菌及理化因素对细菌的影响。内容细菌的人工培养细菌生长繁殖所需要的条件充足的营养适宜的温度嗜冷菌嗜温菌病原菌37℃嗜热菌合适的PH值嗜酸菌嗜中性细菌病原菌7.2~7.6嗜碱菌必需的气体环境根据细菌代谢是对分子氧的需要与否专性需氧菌微需氧菌兼性厌氧菌专性厌氧菌二、细菌的人工培养培养细菌的目的，是从不纯的被检材料中找出特定的细菌或全部细菌，这一过程称为分离培养。如果只是培养性质明确的一种细菌，则称为纯培养。为了从被检材料中分离出所要检查的细菌，可以利用多种性质不同的选择性培养基，检查各种不同的目的细菌。细菌的培养基：（一）培养基的定义：培养基是人工方法配制的含有细菌生长繁殖所需物质的营养基质。其必须本身无菌，一般PH调至7.2~7.6。营养物质水碳源氮源无机盐生长因子（二）制备原则:1.调配营养物质：蛋白胨（氮源），牛肉膏，氯化钠，蒸馏水。2.调配PH：加入缓冲剂，保持PH稳定。3.消毒灭菌。满足a充足的营养物质b合适的PH值c无菌就可制成基础培养基液体培养基+1.5~2.5%琼脂固体培养基+0.3~0.5%琼脂半固体培养基（三）分类：1、按物理性状分类：大量繁殖细菌观察细菌动力短期保存菌种细菌的分离和纯化液体培养基固体斜面培养基半固体培养基固体平板培养基2、按用途分：(1).基础培养基：含有大多数细菌生长所需要的基本营养成分。最常用的为肉汤培养基(2).增菌培养基：在基础培养基中添加生长因子（eg:血清等）或微量元素等其他营养物质或特殊抑制剂。如血平板：5-10%脱纤维羊/兔血，（60°C左右加入血）。巧克力平板:80°C左右加入血。(3).选择培养基：培养基中加入某种/些化学物质，能抑制某类细菌生长而使另一类细菌生长，从而将后者选择出来。常用于肠道致病菌的分离与选择培养。(4).厌氧培养基：用于厌氧菌的分离、培养和鉴定。血平板巧克力平板MacConkey平板X.L.D平板Sabourand平板Mycosel平板几种常用培养基(5).鉴别培养基：根据各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及代谢产物不同，在培养基中加入底物和指示剂来鉴别细菌。1）蓝色半固体培养基2）无色半固体培养基3）基础液体培养基（溴麝香草酚蓝）（醋酸铅）鉴别培养基细菌动力鉴别细菌生化反应鉴别三、各种培养基的接种在医疗实践中或微生物试验中防止周围环境中的微生物污染操作对象，同时防止操作对象的微生物污染周围环境。1.四种接种方式：接种针用于穿刺接种细菌（半固体培养基），接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。（相对无菌）2.任何一个实验，操作前均应在器皿上做标记：时间，菌种，组别。培养皿一般标记在皿底。一）无菌操作接种环的灼烧灭菌先将环端烧热，将接种环提起垂直放在火焰上，烧红，环斜放，沿环向上，至金属杆，再移向环端。来回通过火焰3次，冷却。3．接种。注意：整个实验操作过程都要非常小心，不要碰翻酒精灯，以免烧伤。（1）用左手大姆指、食指、中指和无名指拿住菌种试管，右手拧松棉塞、不取下。接种管宜放在菌种管上面（2）右手拿接种环，在火焰上烧灼灭菌，特别是箍处。（3）火焰边取下两个棉塞，不能放下；烧灼管口一周。（4）将接种环伸入试管内，冷却后，轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。（6）抽出接种环后，烧管口，塞棉塞，接种环灭菌。（5）火焰旁将沾有菌种的接种环迅速伸到斜面培养基的底部，由里向外画蛇形细线，线要画得细些。（二）接种方法1.平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：1）连续划线法：适用于样本含细菌量少，如血液标本2）分区划线法：适用于含菌量较多的标本，如粪便标本固体平板培养基一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。2.固体斜面培养基接种法：作用：观察细菌的培养特性、生化反应、保存菌种。接种方法：连续划线法。生长现象：呈菌苔样生长。3.半固体培养基接种法：11作用：检测细菌动力、生化反应接种方法：接种针穿刺法---用接种针中央直刺，一条线路，底部留空生长现象：沿穿刺线生长----无动力沿穿刺线扩散生长（呈云雾状或羽毛状）---有动力4.液体培养基接种法•作用：增菌及检测生化反应。•接种方法：研磨接种。•生长现象：浑浊、沉淀、菌膜样生长。细菌培养法一般培养（需氧培养）：★培养温度：37℃（采用恒温培养箱）★培养时间：18～24h实验一细菌的人工培养一、细菌在自然界的分布1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱培养24小时，观察结果。2.人体表面细菌的检查---手指（每组1个平皿）方法：取一普通平皿培养基，一部分标记“前”，另一部分标记“后”，然后将手指在标记“前”的部分沾一下，洗手后在标记“后”的部分沾一下。放入37℃温箱培养24h后观察细菌的生长情况。3.人体内部细菌的检查--咽喉部方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约10cm，对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。二、外界因素对细菌的影响：1.物理因素对细菌的影响：紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌，一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作用。方法：取普通琼脂平皿，用用密集划线法接种细菌，然后将平皿盖遮盖一半，用紫外线照射30min，然后放入37℃温箱中孵育24h后观察。2.化学消毒剂：每组普通平板1个，密集划线法。用镊子取无菌圆形滤纸片，蘸消毒药液（75％酒精、84消毒液或碘酒），当滤纸片被提出消毒液面后，应与化学消毒剂瓶口接触停留去除多余药液，然后将其贴在已接种有细菌的平板表面，贴上后用镊子轻轻压一下滤纸片。纸片要平整，各片之间距离要大致相等。每浸一种药液，镊子要灭菌使用。37℃孵育24h，明天观察抑菌环情况。3、抗生素密集划线法操作同化学消毒剂青霉素链霉素庆大霉素青霉素庆大霉素链霉素三、细菌的生化实验：1.葡萄糖发酵试验：蓝色半固体培养基对面两小组，一组大肠杆菌，一组葡萄球菌2.吲哚试验：液体培养基，三菌均可。3.硫化氢试验：半固体无色培养基。两小组大肠杆菌，两小组葡萄球菌，四小组变形杆菌。四、增殖细菌：斜面培养基，三菌均可。各组分开，G+，G-。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？答：空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂菌污染。今天大家首先观察一下昨天接种的细菌的生长情况1、液体培养基中的生长现象•混浊：大多数细菌•沉淀：多见于链状排列的细菌•菌膜：多见于专性需氧菌菌膜菌沉淀均匀浑浊对照2、半固体培养基中的生长现象有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。A、有动力B、无动力C、空白对照3、细菌在固体培养基中的生长现象菌落：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。一、细菌在自然界的分布：1.空气中细菌的分布空气中携带有微生物的气溶胶粒子在地心引力的作用下，自然垂直沉降到琼脂培养基上。意义：1）通过细菌的菌落数来评估空气中细菌的含量2）通过菌落的形态来鉴别细菌的种类3）通过本实验树立有菌和无菌观念2.手指细菌的分布3.咽喉部细菌的分布（先观察有无菌落）上呼吸道是开放性的通道，一般寄居着一定数量和一定种类的微生物，它们在宿主和外环境的影响下保持着微生态的平衡。呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表皮葡萄球菌。二、理化因素对细菌的影响1.物理因素对细菌的影响---紫外线原理：紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰DNA的复制与转录导致细菌变异或死亡。特点：杀菌能力强，而穿透能力弱。普通玻璃、纸张、水蒸气、尘埃等均能阻挡。应用范围：紫外线灭菌法常用于消毒物体表面，手术室、无菌实验室、传染病房的空气消毒及不耐热物品消毒。有无选择性？（1）机制①促进菌体蛋白质变性或凝固。②干扰细菌酶系统和代谢。③损伤细菌的细胞膜，影响细菌的化学组成，物理结构和生理活动，从而发挥防腐、消毒灭菌作用。有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。2.化学因素对细菌的影响---化学消毒剂（2）化学消毒剂分类（1）高效消毒剂杀灭细菌芽胞在内的所有微生物，适用于不耐热力灭菌但要进入人体内部的物品，如内窥镜等。次氯酸钠、过氧化氢、甲醛、环氧乙烷等。（2）中效消毒剂不能杀灭芽胞，但能杀灭繁殖体、真菌和大多病毒，如喉镜，麻醉器材。碘酊、乙醇等。（3）低效消毒剂能杀灭大多细菌繁殖体，但不能杀灭芽胞，结核杆菌及某些抵抗力强的真菌和病毒。新洁尔灭、洗必泰、高锰酸钾等。75％酒精碘酒84消毒液G+菌：+/-+++++G-菌：-++++青霉素-盘尼西林弗莱明1928弗莱明、钱恩、弗罗里于1945年共同获得诺贝尔医学和生理学奖。青霉素是由青霉、曲霉等属真菌产生的一种抗生素。青霉素是人类发现的第一种能够治疗人类疾病的抗生素。但青霉素能引起某些受药者过敏反应，严重时可引起休克、甚至死亡，故应用前必须做皮肤试验。2.化学因素对细菌的影响---抗生素阳性三）生化试验：分解色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）大肠杆菌＋变形杆菌－1、吲哚试验2.葡萄糖发酵试验：蓝色半固体培养基对面两小组，一组大肠杆菌，一组葡萄球菌结果：大肠杆菌组:变黄，云雾状生长葡萄球菌组:紫色变浅？。黄色(PH6.0);指示剂:1％溴麝香草酚蓝蓝色(PH7.6)糖发酵试验3、硫化氢试验（+）含硫氨基酸硫化氢黑色硫化物+铁离子或铅离子二、今天的实验内容：观察细菌形态，进行形态学测定。细菌用上次实验接种在平板或斜面培养基的结果。普通光学显微镜的分辨率为0.25µm,油镜可放大1000倍。一般细菌都大于0.25µm，球菌达到0.8~1.2µm，故可用普通光学显微镜观察。2、油镜使用方法光源：由弱到强光，检查时用最强光集光器：下弱上强，故调到最上方选择油镜头：1000倍，垂直固定。标本片滴香柏油（用完放好），固定，粗螺旋调镜台，至稍微接触玻片后，换细准焦螺旋微调。标本：观察细菌大小，形态，G+/G-，排列。物镜工作距离(mm)低倍目镜10×5.40高倍目镜40×0.39油镜头100×0.113、细菌染色标本制备的基本步骤：1）涂片：原则---均匀适量。液体培养基直接涂，固体半固体先滴半滴生理盐水，然后蘸适量研磨，加入呈浑浊即可。2）自然干燥（酒精灯旁可加快干燥过程）3）火