第5章 蛋白质结构解析

第五章蛋白质结构解析•人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？•人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色。人体中大约有10万种蛋白质。测定蛋白质结构的意义蛋白质三维结构解析方法X-射线晶体衍射法：85.3%核磁共振波谱：14.7%电镜三维重构、各种光谱技术、显微技术和计算机模拟蛋白质三维结构解析过程1895年11月8日,德国物理学家，50岁的伦琴在自己的实验室中偶然发现一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，由于对管子发出的“东西”性质不确定，伦琴就把这种射线命名为“X射线”。图片出处:=4758伦琴实验室第一节X-射线衍射测定蛋白质结构人类第一张X光照片图片出处:伦琴妻子之手1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告。Kolliker教授提议将该射线命名为“伦琴射线”,但伦琴却说：“我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是称它为X射线最恰当。”威廉·康拉德·伦琴WilhelmConradRöntgen1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有17封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处诺贝尔物理奖奖章X射线本质X射线是一种短波长(0.005～10nm)、高能量(2.5×105～1.2×102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，K是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极A撞击而产生X射线。AX射线衍射1912年MaxvonLaue发现X射线具有衍射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）图片出处:劳厄的实验装置图片出处:射线晶体结构分析基本原理X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。X射线通过红宝石晶体(a)和硅单晶体(b)所拍摄的劳厄斑图片出处:劳伦斯·布拉格(LawrenceBragg)亨利·布拉格(HenryBragg)因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献,亨利·布拉格（WilliamHenryBragg）和劳伦斯·布拉格（WilliamLawrenceBragg）父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。图片出处图片出处20世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获得诺贝尔奖；20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成为轰动世界的新闻；20世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；20世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。蛋白质结构解析的发展饶子和院士HIV基质蛋白SARSＸ射线衍射用于蛋白质结构的测定1954年伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白酶晶体Ｘ衍射图片。1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.6nm分辨率的蛋白质晶体结构图片出处:图片出处:肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构模型图片出处:图片出处:年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.55分辨率的晶体结构图片出处:(1962)血红蛋白的四级结构模型图片出处血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的α亚基和二个由146个氨基酸残基组成的β亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科学家M.F.佩鲁茨和J.C.肯德鲁获得1962年的诺贝尔化学奖。图片出处：年,核小体八组蛋白结构2004年,菠菜捕光复合物LHC-II2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期蛋白质X射线晶体结构测定程序1、样品制备2、蛋白质结晶和晶体生长3、衍射数据收集和处理4、位相求解5、模型建立和修正1、样品制备大量表达、分离和纯化目标蛋白一般要求纯度大于97%，浓度达到5mg/ml以上。2、蛋白质结晶和晶体生长蛋白质结晶原理与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出蛋白质晶体生长的影响因素物理因素：温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等化学因素：pH值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等生化因素：蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和等电点等蛋白质结晶方法（1）批量结晶法（Batchcrystallization）（2）透析法(Dialysis)（3）液相扩散法(Liquiddiffusion)（4）气相扩散法（Vapourdiffusion）（5）蛋白质结晶新方法（1）批量结晶法（Batchcrystallization）通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度和组成固定的条件下，直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。（2）透析法(Dialysis)利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培养蛋白质晶体的常用方法。（3）液相扩散法(Liquiddiffusion)利用液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。（4）气相扩散法（Vapourdiffusion）把待结晶蛋白质、高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。（5）结晶新方法Nucleant生物玻璃晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等3、衍射数据收集和处理第三代同步辐射光源的应用使得用20-40um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个：APS（USA）;ESRF（France）;SPring-8（Japan）上海同步辐射中心同步辐射光源晶体收集和储存液氮气冷技术4、位相求解1.分子置换法(MR)2.多对同晶型置换法(MIR)3.多波长反常散射法(MAD)实验中经常联合使用分子置换法(MR)分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。多对同晶型置换法(MIR)在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如Pb和Hg等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。多波长反常散射法(MAD)利用同步辐射波长连续可变的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。5、模型建立和修正晶体学R因子一般要求达到0.2以下键长偏差大约为0.015Å键角偏差约为3°二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制X-Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。第二节NMR测定蛋白质结构核磁共振技术（NMR）1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。1983年，瑞士科学家KurtWüthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象.发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖74岁的美国科学家保罗·劳特布尔和70岁的英国科学家彼得·曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主NMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱仪核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。15核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪1．永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2．射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。3