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动物的克隆动物细胞与组织培养克隆培养法单克隆抗体细胞核移植动物的克隆常用技术动物细胞融合动物克隆的技术基础是动物细胞与组织培养细胞工程的主要手段是细胞培养和细胞融合资料：培养细胞的生存环境1.无菌、无毒环境：添加一定量的抗生素，定期更换培养液2.适宜的温度和PH：35-37℃;PH:7.2-7.43.气体环境（CO2培养箱）4.特殊的培养液：主要有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等调节PH，模拟人和哺乳动物细胞在体内的最适环境思考：较植物组培培养基有何独特之处？1.液体培养基；2.葡萄糖.3、动物血清含激素，保证细胞顺利生长增殖细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果获得细胞或细胞产物培育新植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较一、动物细胞培养首先，将动物体内的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后，在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃致接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。注意：细胞之间在生命活动中相互依存，所以也像体内一样呈现一定的组织特性。细胞贴壁细胞贴壁：细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。在培养的过程中，细胞会结构和功能的变化细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。接触抑制成纤维细胞型：思考几个问题•1、在大多数细胞培养中都不直接使用人的皮肤作为材料而是选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织,为什么？2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？3、胰蛋白酶的作用？胃蛋白酶可以吗？4、为什么要分装？5、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？培养的细胞会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般是指从开始到传至10代细胞的培养传代培养：将原代细胞分成若干份，接种到其他培养基中，使其继续生长繁殖。传代培养一般指10-50代细胞的培养细胞的原代培养将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。胰酶消化法1、取材：用手术剪将组织剪成小块（1mm2），再洗三次，转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次.5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。6、静置，使未分散的组织块下沉。7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，37℃下培养。（一）培养细胞生命期在培养中持续增殖和生长的时间。1．原代培养期：从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）特点：细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性、多呈二倍体核型细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。2．传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3．衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。细胞悬液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养总结多呈二倍体核型细胞群是异质的传代后称做细胞系转化的细胞可能获得永生性或恶性—异体致瘤永生性也称不死性，又称无限细胞系，也称连续细胞系，大多变成异倍体有限细胞系（二倍体）细胞系、细胞株细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。特点：一般具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等。连续细胞株：可以连续多次传代的有限细胞株：可传代次数有限细胞系：异质性细胞株：纯系★如何获得纯系的细胞系？把一个细胞从群体中分离出来单独培养（克隆培养法）二、克隆培养法1、克隆培养法概念：把一个细胞从群体中分离出来培养，使之繁殖成一个新的细胞群体的技术。（克隆培养与群体培养是一个等位概念）2、特征：纯系（遗传性状均一、表现性状相似）3、基本要求：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个。4、克隆的难易程度:•单细胞不如群体细胞•原代细胞、有限细胞系＜连续细胞系、转化或肿瘤细胞5、提高克隆形成率的措施：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清）、滋养细胞（如经射线照射本身是去增值力的小鼠成纤维细胞）、激素（胰岛素等）刺激、CO2培养箱、调节PH值等6、用途：如从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。三、动物的细胞融合技术及其应用★什么是细胞融合技术？★为什么要进行细胞融合？★如何实现细胞融合？定义指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。1、动物细胞融合受精作用两个细胞正在融合诱导融合的因素•生物法：灭活的仙台病毒诱导融合利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。•化学法：聚乙二醇诱导融合因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。•物理法：电刺激诱导融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞5、应用1.由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。3.利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。2.克服远缘杂交不亲和的障碍鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡、人—胡萝卜等此技术有什么缺点和优点？小鼠单克隆抗体的制备杂交瘤的制备•融合前的准备工作•细胞融合•杂交瘤细胞的筛选•单克隆抗体的大量制备主要设备•净化工作台超净工作台是一个无菌操作装置，其原理是内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器净化后，让净化后空气徐徐通过台面空间，使工作场地构成无菌环境。组织培养材料的准备主要设备•CO2恒温培养箱骨髓瘤和杂交瘤细胞培养都需要在恒定温度条件下才能生存，温度变化一般不应超过0.5度。因此要求培养箱应具有较高的灵敏度；电热恒温箱质量关键在于控温装置的优劣。CO2恒温培养箱已成为普遍应用的设备，优点是箱内能恒定地提供一定量的二氧化碳，通常用5%，可使培养液维持稳定的pH，减少调pH的麻烦。组织培养材料的准备主要设备•离心机培养细胞经常需要制备细胞悬液、漂洗，需离心分离细胞，要求每分1000转左右，故一般小型台式离心机即符合要求。组织培养材料的准备主要设备•培养液过滤装置各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌做消毒处理。现多用微孔滤膜，密度有不同型号，尺寸有不同规格。组织培养材料的准备主要设备•多孔培养板、塑料器皿组织培养材料的准备骨髓瘤细胞悬液的制备骨髓瘤细胞扩大培养50ml离心管1000r/min离心5-10min离心洗涤骨髓瘤细胞悬液活细胞计数后备用融合前48-36h融合当天30ml不完全培养基10ml不完全培养基0.4%台盼蓝染液脾细胞悬液的制备小鼠脾脏直径10cm平皿剥离周围结缔组织剪刀剪碎、注射器芯挤压单细胞悬液直径10cm平皿10ml不完全培养基铜网过滤10ml不完全培养基轻轻洗涤脾细胞悬液的制备脾细胞悬液1000r/min离心5-10min离心洗涤1-2次脾细胞悬液活细胞计数后备用50ml不完全培养基10ml不完全培养基0.4%台盼蓝染液1234mmmm12341234单克隆抗体细胞融合取出脾细胞+癌细胞各抗体分开传统抗血清抗原免疫所有抗体混合1234BALB/c12341234B细胞抗原免疫小鼠后，其脾脏会产生分泌抗体的各种B细胞。每种B细胞只能分泌一种抗体，对抗各自的抗原决定基。传统抗血清便是所有抗体的混合，得以有效保护动物个体。假如能够把单一个B细胞挑出来培养，则可收获单一种抗体。但是，B细胞无法在试管中培养生长。癌细胞可以在试管中持续培养生长，但无法产生所要的抗体。这些单独的融合细胞可以大量生产单独一种抗体，就是单克隆抗体。若把B细胞与癌细胞融合，所得到的融合细胞则可分別培养。骨髓瘤细胞致敏的B淋巴细胞杂交瘤骨髓瘤细胞脾细胞杂交瘤细胞融合后细胞的类型:杂交瘤技术的理论基础融合细胞筛选技术融合细胞筛选技术生化代谢缺陷型骨髓瘤细胞系单克隆抗体产生的原理HAT培养基根据筛选杂交瘤细胞的特殊培养液。融合后细胞在HAT培养基中存活情况不能长期生长死亡生化代谢正常能够长期生长生长繁殖死亡生化代谢缺陷能够长期生长生化代谢正常杂交瘤细胞的筛选脾细胞骨髓瘤细胞细胞融合HAT初步筛选筛选阳性克隆单克隆抗体产生的原理操作步骤•筛选阳性细胞克隆每孔加待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性（免疫鼠血清）、阴性对照（完全培养基）和空白对照。单克隆抗体的大量制备•动物体内生产法•体外培养法小鼠腹水诱导细胞培养液制备杂交瘤培养上清杂交瘤细胞扩增1:10比例转入新瓶离心、收集上清检测抗体滴度分装、无菌保存37℃5％CO25d制备单克隆抗体腹水•动物体内生产单抗是最实用的大量制备单抗方法。•使用动物首选BALB/c小鼠。•原理：将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。•注射细胞前一般先用降植烷或液体石蜡处理腹腔，以便产生大量腹水。•缺点：腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）；有污染动物病毒的危险。制备单克隆抗体腹水腹腔接种降植烷或液体石蜡（0.5-1ml/只）7-10天腹腔接种无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，5×105/只制备单克隆抗体腹水7-10天采集腹水2000r/min，5min收集上清，测定抗体效价分装，冻存备用思考：（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。（2）骨髓瘤细胞是癌细胞吗？有无限增殖能力的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以瘤细胞不能等同于癌细胞。（3）制备过程为何要经过两次筛选？第一次筛选获得多种杂交瘤细胞第二次筛选出特异抗体的杂交瘤细胞。(5)本过程利用了哪些原理？免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理（4）制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？细胞融合技术、细胞培养技术。动物细胞融合技术B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤只有杂交瘤细胞才能活动物细胞培养技术获得产生相应抗体的B淋巴细胞获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞获得杂交瘤细胞1975年，米尔斯坦（英）和科勒（德）融合选择性培养基抗体检测问题探究1.第一次筛选和第二次筛选的目的有何不同？2.单克隆抗体有何特点？单克隆抗体的优点：化学性质单一，特异性强，灵敏度高。第一次筛选：用选择性培养基获得杂交瘤细胞。第二次筛选：通过抗体检测获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞。四、动物的克隆繁殖★理论上，分化的动物细胞