基因工程

第四章基因工程(geneticengineering)第一节基因工程的基本知识一、基本概念DNA重组(DNArecombination）：不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。基因工程(geneticengineering)：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。二、工具酶（一）限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的概念能够切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。2.限制性核酸内切酶的识别和切割位点大部分限制性核酸内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征，通常是4～6碱基对，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5′磷酸基和3′羟基末端。3种不同的情况：（1）产生5′突出粘性末端：（2）产生3′突出粘性末端：（3）产生平末端：（二）其它工具酶1.DNA连接酶（DNAligase)：双链中一条完整的单链可作模板，另一条单链中的切口位点不缺少任何核苷酸，切口有相邻的5’-磷酸和3’-羟基末端，使单链切口形成磷酸二酯健，共价连接2.DNA聚合酶：用途：（1）合成cDNA第二条链（2）对DNA3’端进行填补和末端标记（3）Taq酶聚合链式反应等3.逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶mRNA逆转录成cDNA4.碱性磷酸酶：特异性切除DNA或RNA5’端的磷酸基，防止载体的自身连接5.多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，能催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5’羟基上（1）放射性标记5’端（2）用于连接反应6.末端脱氧核苷酸转移酶小牛胸腺中分离，催化单核苷酸转移到DNA的3’端羟基上三、载体载体的一般要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，并有较高的拷贝数；②容易进入宿主细胞；④容易从宿主细胞中分离纯化；⑤有容易被识别筛选的标志③具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即为多克隆位点；（一）质粒(plasmid)质粒(plasmid)是细菌中存在的独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分。多为双链共价闭合环形DNA。如pBR322质粒：长度为4.3kb，含有氨苄青霉素（ampr）、卡那霉素（kanr）和四环素（tetr）的抗性基因AmpR_promoter2556-2528lac_promoter543–514M13_pUC_rev_primer500–478pBR322_origin147-1852M13_reverse_primer479–461M13_forward20_primer379–395M13_pUC_fwd_primer364–386lacZ_a393–250Ampicillin2486-1626(二)噬菌体(bacteriophage，phage)噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。λ噬菌体λ噬菌体两端各有12个碱基互补的单链末端（cos末端）λ噬菌体进大肠杆菌后两端的cos末端环化成双链双链以两种不同的形式繁殖1.溶菌性方式，连续增殖，直到细菌裂解，释放出的噬菌体又去感染其他细菌2.溶原性方式：将自身的DNA整合到细菌染色体中，和细菌染色体一起复制λ噬菌体优点：1.是一种温和的噬菌体，他对大肠杆菌具有很高的感染能力2.能承载较大的外源DNA片断，λ噬菌体上有约20kb区域对于λ噬菌体的生长不是绝对需要，可以缺失或被外源DNA片断取代3.λ噬菌体上有许多限制性内切酶识别位点，适合于多种外源DNA酶切片断克隆构建λ噬菌体载体思路1.使用限制性酶切去λ噬菌体上的非必需区，确定一种限制酶识别序列作用克隆点，删除这种酶在λDNA上的多余识别序列2.λDNA的非必需区引入选择性标记基因3.建立重组λDNA分子体后包装系统成为有活性的噬菌体颗粒(三)粘粒（cosmid）粘粒（cosmid）是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。质粒提供了复制的起始点、酶切位点、抗生素抗性基因，而cos区提供了粘粒重组外源DNA大片段后的包装基础。①动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。②有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。（四）、病毒④有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor)。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，即构成了一种高效的转化体系。包装细胞为了使重组病毒DNA分子包装成病毒颗粒，使其成为一个有感染力的重组病毒颗粒，需要构建一个病毒包装细胞，又称为辅助细胞。在包装细胞内，染色体中整合了除Ψ序列的整个辅助病毒基因组，由于缺乏Ψ序列，病毒蛋白不能包装成病毒颗粒，但它能为重组病毒载体转录的RNA提供包装蛋白四、重组DNA技术的基本过程重组DNA技术的基本步骤：①制备目的基因和相关载体；②将目的基因和载体进行连接；③将重组的DNA导入受体细胞；④DNA重组体的筛选和鉴定；⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究。1.目的基因的制备（1）基因组DNA文库采用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片断都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有重组DNA都引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这个混合体称为基因文库。完成DNA重组后可通过杂交筛选获得特定的基因片断1.目的基因的制备（2）cDNA文库以mRNA为模板，经逆转录酶催化合成cDNA，将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这个混合体就叫做cDNA文库可通过杂交筛选获得特定的cDNA克隆。1.目的基因的制备（3）聚合酶链式反应已经知道目的基因的序列，可以用PCR从基因组DNA中获得目的基因，也可以采用RT-PCR技术直接从mRNA获得基因的cDNA1.目的基因的制备（4）化学合成知道肽链的氨基酸顺序，按照对应密码子推导出DNA的碱基序列，然后利用化学方法合成2.目的基因与载体的连接（1）黏性末端的连接（2）同聚物加尾连接：末端核苷酸转移酶（3）平末端连接：效率比黏末端连接低很多（4）人工接头连接第二节聚合酶链反应PCR多聚酶链式反应是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增1、变性（94℃）：使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA2、退火（55℃）：引物和其互补的模板在局部形成杂交链3、延伸（72℃）：通过TaqDNA聚合酶使4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从5`向3`端方向延伸，合成与模板DNA的互补链。以上3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。双链DNA分子双链断开循环1模板与引物结合循环1TaqTaq循环1TaqTaq循环1循环1双链断开循环2模板与引物结合循环2TaqTaqTaqTaq循环294℃变性双链断开循环3循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq循环3循环nPCR反应混合液的制备（一般50-100μl体积）1.DNA：用量根据分子量大小加以调整，一般含102-105拷贝2.dNTP（10mM）0.4μl左右3.引物4.缓冲液（KCl和Tris-HCl）5.dd水RT-PCR原理首先将Mrna逆转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。逆转录反应体系一般选用20μl体积